Author(s): Almeida, Vanessa
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.18/1619
Origin: Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde
Subject(s): HIV-1; PCR em Tempo Real; Regiões LTR e pol; Sensibilidade; Especificidade; Infecções Sexualmente Transmissíveis
Dissertação de mestrado em Biologia (Biologia Humana e Ambiente), apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2012.
[PT] As crianças verticalmente infetadas por VIH-1 têm elevado risco de progressão para SIDA nos primeiros anos de vida. Por um lado, este facto evidencia a importância do diagnóstico precoce da infeção permitindo tratamento atempado, e por outro lado, fundamenta ainda a procura constante da melhoria dos ensaios experimentais de diagnóstico. A técnica de nested PCR implementada no laboratório para diagnóstico precoce é sensível e específica, mas obriga a uma manipulação de produtos amplificados com maior risco da ocorrência de contaminações. É também considerado um método moroso já que associa a duas reações de amplificação sequenciais uma eletroforese em gel de agarose para deteção dos produtos amplificados. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um ensaio experimental sensível e específico, alternativo à técnica de nested PCR, que pudesse conduzir à obtenção de ganhos no tempo de saída de resultados e na redução do risco de ocorrência de contaminações. Diferentes ensaios experimentais de PCR em Tempo Real foram desenvolvidos para a amplificação de fragmentos do VIH-1 (região LTR e pol) e efetuada uma avaliação prévia de resultados com a utilização de 3 grupos de amostras de referência: amostras positivas (n=15), amostras com ADN VIH-1 quantificado (n=8) e amostras negativas (n=11, positivas para VIH-2). Nos ensaios, foram diretamente testadas amostras de ADN viral extraído de CMSP ou sintetizado a partir de plasma, e também, amostras correspondentes a produtos de PCR gerados por uma prévia amplificação do ADN através de PCR Convencional. Foi selecionado o algoritmo experimental que revelou melhor desempenho na deteção da infeção VIH-1 para análise de amostras clinicas. Estas amostras foram obtidas entre 2009 e 2011, e correspondem a amostras colhidas a mães infetadas (positivas VIH-1, n=149) e a filhos em que não ocorreu a transmissão do vírus (amostras negativas, n=20). O algoritmo experimental em Tempo Real escolhido correspondeu à amplificação de fragmentos de VIH-1 (região LTR) utilizando a combinação dos primers HL456N e HL602C com a sonda TaqMan SHL478N, a partir de amostras de ADN previamente submetidas a PCR Convencional com os primers externos HL456N e HL650C. Em resultado da prévia avaliação com amostras de referência, este algoritmo revelou sensibilidade de 86,7% e um limite de deteção ADN VIH-1 de 0,8 cópias/amostra. Com amostras clínicas foi obtida uma sensibilidade de 75,2 % e de especificidade de 100%. A confirmação da infeção com primeiras e segundas amostras foi conseguida em 87,5% dos casos (112 casos positivos entre 128 estudados). Foi também obtido um valor de Kappa de 0,417 que mostrou uma concordância moderada entre resultados esperados e obtidos. Comparativamente, na técnica de nested PCR eram conhecidos valores de sensibilidade e especificidade respetivamente de 81,9% e 100% e uma concordância estimada pelo valor de Kappa de 0,565. A confirmação dos casos de infeção com primeiras e segundas amostras foi conseguida em 95,3% dos casos (122 casos positivos entre 128 estudados). Embora se tenha conseguido informação útil e obtido ganhos em tempo através do algoritmo experimental desenvolvido, este apresenta sensibilidade inferior à técnica de nested PCR utilizada no laboratório. Deste modo, para além do aumento da população/amostras em estudo, que se concluiu ser necessário para melhor tratamento estatístico dos resultados, será também essencial um incremento da sensibilidade dos ensaios que poderá ser obtido explorando outras regiões genómicas alvo alternativas às utilizadas no presente estudo.
[ENG] Vertically HIV-1 infected children have increased risk of progression to AIDS in the early years of life. On one hand, this highlights the importance of early detection of infection enabling prompt treatment, and moreover, underlies the constant search for improved experimental tests for diagnosis. The nested PCR technique implemented in the laboratory for early diagnosis of HIV infection is sensitive and specific but requires handling of amplified products with a higher risk of contamination. It is also considered a time consuming method that combines two sequential amplification reactions and agarose gel electrophoresis for detection of amplified products. The aim of this study was to develop a sensitive and specific assay, alternative to nested PCR technique, which could lead to gains in response time and reducing the risks of contamination. Different experimental assays of Real Time PCR were developed for amplification of fragments of HIV-1 (LTR and pol region) and a preliminary evaluation of results was performed with the use of three groups of reference samples: positive samples (n= 15), quantified DNA HIV-1 samples (n= 8) and negative samples (n= 11, positive for HIV-2). In the assays were directly tested samples of viral DNA, extracted from PBMC or synthesized from plasma, and also samples corresponding to PCR products generated by a previous amplification of the DNA by Conventional PCR. The experimental algorithm that showed better performance in the detection of HIV-1 infection was selected to analyze the clinical samples which were obtained between 2009 and 2011, and correspond to samples collected from the infected mothers (HIV-1 positive, n= 149) and children to whom no virus transmission occurred (negative, n= 20). The chosen experimental algorithm for Real Time amplification corresponded to fragments of HIV-1 (LTR region) using the combination of primers HL456N, HL602C and SHL478N TaqMan probe, from DNA samples previously subjected to conventional PCR with the external primers HL456N and HL650C. As a result of preliminary evaluation, this algorithm has shown a sensitivity of 86.7% and a detection limit of 0.8 copies for sample. In clinical samples was obtained a sensitivity of 75.2% and specificity of 100%. Confirmation of infection with first and second samples was achieved in 87.5% of cases (112 positive cases among 128 studied). It has also obtained a Kappa value of 0.417 which showed a moderate agreement between expected and obtained results. Comparatively, for the nested PCR technique were known sensitivity and specificity of 81.9% and 100% respectively and a concordance estimated by Kappa value of 0.565. The confirmation of infection cases with first and second samples was achieved in 95.3% of cases (122 cases between 128 positives). Although this study has achieved useful information and gains in time through the algorithm developed, this shows lower sensitivity than the nested PCR technique already used in the laboratory. Thus, in addition to the increase in population/samples to be analyzed for improved statistical treatment of the results, is also essential an increment in the sensitivity of assays which can be obtained by exploring other genomic regions alternatives to the target used in this study.
