Caracterização dos mecanismos de resistência à ampicilina em estirpes clínicas de Haemophilus influenzae isoladas em Portugal entre o período de 2009 a 2012

• Author(s): Barrulas Guilherme, Elsa
• Date: 2013
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.18/2165
• Origin: Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde
• Subject(s): Haemophilus Influenzae; Resistência aos Antibióticos; Antibióticos β-lactâmicos; Proteínas de Ligação à Penicilina (PBP3; Gene ftsI; Infecções Respiratórias
• Document Type: Master thesis
• Language: Portuguese
• Advisor(s): Lavado, Maria Paula Bajanca; Dias, Deodália Maria Antunes
• Contributor(s): Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde

Description

Dissertação de mestrado em Biologia (Biologia Humana e Ambiente) apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2013.

Orientadora: Maria Paula Bajanca Lavado (INSA, IP).

[PT] O Haemophilus influenzae (H. Influenzae) é uma bactéria Gram-negativa restrita ao aparelho respiratório humano, normalmente responsável por infeções respiratórias adquiridas na comunidade. A gravidade destas infeções resulta inicialmente num diagnóstico presuntivo, sendo posteriormente estabelecido um tratamento antibiótico empírico. A resistência desta bactéria aos antibióticos β-lactâmicos pode constituir sérias implicações a nível clínico, sendo que, o uso inapropriado destes antibióticos e a utilização de antibióticos de largo espectro têm contribuído grandemente para a emergência da resistência a esta classe de antibióticos. A resistência à ampicilina pode ser mediada por dois mecanismos: a produção de enzima β-lactamase, responsável pela inativação enzimática dos antibióticos β-lactâmicos, e pela presença de proteínas de ligação à penicilina alteradas que se traduz numa diminuição da afinidade aos mesmos. A amostra de 248 estirpes clínicas de H. influenzae foi selecionada com base na concentração inibitória mínima (CIM) à ampicilina, tendo como objetivo a caracterização dos mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos em estirpes clínicas isoladas em Portugal. Foram estudadas 140 estirpes não produtoras de β-lactamase com CIM à ampicilina ≥1mg/L, 66 estirpes produtoras de β-lactamase com CIM≥8mg/L, e ainda um grupo controlo de 42 estirpes suscetíveis com CIM1mg/L. A sequência do gene ftsI foi amplificada e sequenciada para todas as estirpes. Da totalidade, 204 estirpes apresentavam mutações na região da transpeptidase do gene ftsI, nomeadamente 136 gBLNAR de 140 estirpes BLNAR, 24 gBLNAR de 42 estirpes BLNAS e 44 gBLPACR de 66 estirpes BLPAR. Foram identificados 40 padrões mutacionais que foram incluídos em grupos e subgrupos previamente descritos (I, IIa, IIb, IIc, IId e III-like). A análise destes padrões permitiu a classificação da maioria das estirpes no grupo mutacional II (78,5%), e as substituições aminoacídicas mais frequentes situavam-se próximo do domínio KTG: Val547Ile (88,7%), Asn526Lys (76,9%) e Asn569Ser (72,6%). A relação entre as mutações identificadas e os níveis de suscetibilidade à ampicilina permitiu constatar que 8,8% das estirpes eram suscetíveis, 8,8% eram resistentes devido à produção de β-lactamase (BLPAR), 64,5% eram resistentes pela alteração das PBPs, e 17,7% apresentavam ambos os mecanismos de resistência (BLPACR). Comparando estes resultados com os resultados obtido no período 2001-2008, verificou-se um aumento do número de estirpes suscetíveis à ampicilina, e também do número de estirpes resistentes com mutações no gene ftsI. Pela caracterização das estirpes e relação clonal entre as estirpes BLNAR e BLPACR por Multilocus Sequence Typing (MLST), verificou-se que as estirpes BLNAR apresentam uma grande heterogeneidade genética e que as estirpes BLPACR também não aparentam ter uma grande proximidade filogenética entre si.

[ENG] Haemophilus influenzae are Gram-negative bacilli restricted to the human respiratory tract and responsible for community-acquired respiratory tract infections. Due to the severity of these infections, it is standard procedure to perform a presumptive diagnostic test followed by an empirical antibiotic treatment. The developed resistance of these bacteria to the β-lactam antibiotics may constitute serious implications at the clinical level, and the inappropriate use of antibiotics or the use of broad-spectrum antibiotics has contributed greatly to the emergence of β-lactam antibiotic resistance. H. influenzae β-lactam antibiotic resistance develops via two mechanisms: β-lactamase production, which is responsible for the enzymatic inactivation of these antibiotics, especially β-lactams, and a change in the penicillin-binding proteins, which means decreased affinity to β-lactams. A sample of 248 clinical isolates of H. influenzae were selected according to their Minimum Inhibitory Concentration (MIC) to Ampicillin, with the purpose of characterizing β-lactam antibiotics resistance mechanisms in clinical strains isolated in Portugal. In total, this study analyzed 140 β-lactamase-non-producing strains (BLNAR) with ampicillin MIC≥1mg/L, 66 β- lactamase producing strains (BLPAR) with MIC≥8mg/L, and a control group of 42 β- lactamase-non-producing ampicillin susceptible strains (BLNAS) with MIC1mg/L. The ftsI gene encoding PBP3 was amplified and sequenced to all strains. Of the 248 H. influenzae strains, 204 had mutations in the ftsI transpeptidase domain as follows: 136 gBLNAR out of 140 BLNAR strains, 24 gBLNAR out of 42 BLNAS strains and 44 gBLPACR out of 66 BLPAR strains. Among gBLNAR and gBLPACR strains there were 40 different mutation patterns, that were included in the six previously described groups and subgroups (I, IIa, IIb, IIc, IId, III-like). The analysis of these patterns included the majority of the strains in group II (78,5%) and the most common amino acid substitutions were located near KTG motif: Val547Ile (88,7%), Asn526Lys (76,9%) and Asn569Ser (72,6%). The relation between these mutations and ampicillin susceptibility values showed that 8,8% of these strains were susceptible, 8,8% were resistant to ampicillin due to β-lactamase producing (BLPAR), 64,5% were resistant due to changes on the PBPs (BLNAR), and 17,7% had both resistant mechanisms (BLPACR). Comparing these results with previous ones obtained between 2001 and 2008, it was possible to verify that there was a rising of the strains susceptible to ampicillin (BLNAS), as well as resistant strains (BLNAR) with mutations in the ftsI gene. Through Multilocus Sequence Typing (MLST) it was possible to characterize the strains and study the clonal relationship between BLNAR and BLPACR. The BLNAR strains have a diverse genetic heterogeneity and the BLPACR strains did not seem to present a close phylogenetic relationship between them.