Sources and routes of transmission of Q fever: detection, identification and molecular typing of Coxiella burnetti in domestic and wild animals

• Author(s): Cumbassá, Aminata, 1981-
• Date: 2013
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/10012
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Febre Q; Carraças; Coxiella burnetii; Teses de mestrado - 2013
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Botelho, Ana; Chambel, Lélia Mariana Marcão, 1964-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013

Query fever (Q fever) is a worldwide zoonosis, affecting many animal species, including Men. This zoonotic disease is caused by Coxiella burnetii, an obligate intracellular, Gram-negative filter-passing (0.3 μm) bacterium. Ticks are considered the natural primary reservoir of Coxiella burnetii, responsible for the spread of the infection in wild and domestic animals. Domestic ruminants contaminate the environment by shedding Coxiella in milk, feces, urine, saliva, vaginal secretions, placenta and amniotic fluids, being the main source of human infection. In animals, C. burnetii can cause abortion, premature birth, dead or delivery of weak offspring. Detection of sources of infection and routes of transmission, are essential for the control of C. burnetii spread among animals and transmission from animals to humans. The aim of this work is the molecular detection and characterization of Coxiella burnetii in animal samples, to elucidate the population structure of this agent in Portugal, for surveillance and epidemiological purposes. A nested-touchdown PCR assay (Trans-PCR), targeting the repetitive transposon-like element of C. burnetii insertion sequence IS1111, was performed on 229 DNA tissues and cloacal swab samples, from domestic and wild animals. 19 of them tested positive for C. burnetii (14 in domestic and five in wild animals), revealing a prevalence of infection of 8.3% within this sample panel. All 19 cloacal swabs from vultures tested negative. Multiple locus variable-number of tandem-repeat analysis (MLVA) was used to genotype the 19 C. burnetii positive samples, using a set of six VNTR loci (Ms23, Ms24, Ms27, Ms28, Ms33 and Ms34). Seven different completed profiles (M1 to M7) and nine partial profiles were observed. The calculated discriminatory power of MLVA was 0.94 for our sample setting, and the diversity indexes (D) of the individual markers ranged between 0.73 and 0.95, being loci Ms33 the most discriminatory one. UPGMA clustering of the MLVA data grouped the C. burnetii samples into eight different clusters, being cluster IV the one that included more MLVA types: M1 and M4. Clustering of the MLVA genotypes using the minimum spanning tree method (MST) grouped cattle and goat samples from this study in one branch, while two samples from the same sheep were grouped completely apart in another branch. Using only completed profiles, this analysis corroborate the hierarchical UPGMA data, confirming cluster IV as the most representative of our sample setting. None of our samples clustered with animal or human data reported previously in Portugal, or with reference strains, showing a high diversity among the panel sample.

A febre Q é uma zoonose bacteriana com incidência a nível mundial, que afeta muitas espécies animais, incluindo o Homem. Foi descrita pela primeira vez em 1935, em Queensland, Austrália, devido a um surto de doença febril de origem desconhecida, entre os trabalhadores de um matadouro. Como não havia sido descrita até então, foi denominada “Query fever” que significa “febre desconhecida”. Esta zoonose é causada por Coxiella burnetii, uma bactéria intracelular obrigatória, Gram-negativa. A espécie foi isolada pela primeira vez de uma carraça em 1938, em Nine Mile Creek, EUA. As carraças são consideradas o reservatório primário natural da bactéria e são os responsáveis pela sua transmissão aos animais domésticos (bovinos, ovinos, caprinos, suínos, cães, gatos) e selvagens (pássaros e outros), através das suas fezes e/ou mordidas. Os animais domésticos, por sua vez, são os principais responsáveis pela transmissão da C. burnetii aos humanos, através do leite, fezes, urina, saliva, secreções vaginais (especialmente após o parto), placenta e fluidos amnióticos. As infeções por C. burnetii podem resultar em abortos, partos prematuros e morte, causando graves transtornos económicos a nível de produção animal. A deteção das fontes de infeção e vias de transmissão da bactéria são essenciais para o controlo da sua disseminação entre os animais e da sua transmissão dos animais para os humanos. Este estudo tem como objetivo a avaliação de métodos de deteção molecular e a caracterização de C. burnetii em amostras de tecidos animais (domésticos e selvagens), com o propósito de esclarecer qual a estrutura populacional deste microrganismo em Portugal, para fins epidemiológicos e de vigilância. Analisamos um total de 229 amostras de DNA, extraídos de diferentes tecidos de animais domésticos e selvagens, através da técnica de Trans-PCR, que utiliza dois pares de iniciadores (Trans1/Trans2 e Trans3/Trans4), desenhados para amplificar a região repetitiva tipo-transposónica na sequência de inserção IS1111 existente no genoma de C. burnetii. Trata-se de um PCR “nested” altamente específico e sensível, em que o primeiro par de iniciadores (Trans1/Trans2) amplifica uma região de 687 pb, sendo o produto dessa primeira amplificação utilizado como molde na reação com o segundo par de iniciadores (Trans3/Trans4), que amplificam uma região de 243 pb. Dezanove amostras (14 animais domésticos e 5 sacarrabos selvagens) foram positivas para C. burnetii, revelando uma prevalência de 8,3% no painel de amostras testadas. Todas as 19 zaragatoas cloacais de abutres selvagens analisadas foram negativas para o agente. As amostras positivas foram posteriormente testadas por qRT-PCR, para quantificar o DNA alvo de C. burnetii existente em cada uma, através de valores de cycle threshold (Ct). Esses valores são inversamente proporcionais à quantidade de DNA alvo existente, uma vez que Ct é definido com o sendo o número de ciclos necessários para o sinal fluorescente exceder o limiar de interferências que possam existir na amostra. Quanto mais baixos os valores de Ct, maior a quantidade de DNA na amostra. Esta medida permitiu-nos ter uma indicação de quais as amostras que melhores resultados dariam na tipificação por “Multiple locus variable-number of tandem-repeats analysis” (MLVA) pois, de acordo com artigos publicados, amostras com valores de Ct >35 são dificilmente tipificáveis. A tipificação molecular por MLVA foi feita com o objectivo de estudar as principais fontes de infeção e vias de transmissão de Coxiella. É uma técnica que se baseia nas variações que ocorrem naturalmente no número de sequências de DNA repetidas em “tandem”, no genoma das bactérias. Neste estudo, incluímos todas as 19 amostras, independentemente do Ct obtido, tendo conseguido tipificar algumas de Ct mais alto, apesar de outras de baixo Ct não serem tipificáveis, usando um conjunto de seis loci VNTR com unidades repetitivas de seis (Ms27, Ms28 e Ms34) ou 7 pares de bases (Ms23, Ms24 e Ms33). Obtivemos sete perfis completos diferentes, designados de M1 a M7, e nove perfis parciais, revelando esta técnica uma capacidade discriminatória (HGDI) de 0,93. Para cada marcador individual os índices discriminatórios situaram-se entre 0,73 e 0,95, sendo o locus Ms33 o mais discriminatório. Os dados obtidos por MLVA foram agrupados pelo método hierárquico com o coeficiente e método de aglomeração UPGMA [BioNumerics 6.6 (Applied Maths, Bélgica)] em sete grupos diferentes, sendo o grupo IV aquele com maior número de tipos MLVA (M1 e M4). Utilizando apenas perfis completos para todos os loci, verificamos com o método do “Minimum spanning tree” (MST) que as amostras de DNA de C. burnetii de bovino, ovino e caprino se agrupavam num ramo, enquanto que duas amostras de ovino do mesmo animal ficavam noutro ramo. Esta análise veio corroborar os resultados da análise hierárquica, confirmando o grupo IV como sendo o mais representativo do nosso conjunto de amostras. Nenhuma das amostras agrupou com outros perfis, de animais e de humanos, previamente publicados em Portugal, ou com estirpes de referência de C. burnetii sequenciadas, mostrando uma grande diversidade e exclusividade das amostras por nós analisadas.