Author(s): Silva, Filipa Magalhães, 1990-
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/10070
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Doença de Parkinson; Saccharomyces cerevisiae; Fosforilação; Agregação celular; Teses de mestrado - 2013
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela presença de inclusões proteicas designadas por corpos de Lewy (LB). Os LB são agregados intracelulares que se formam nos neurónios dopaminérgicos, localizados na substantia nigra, mas que podem ocorrer em outras áreas do cérebro à medida que a doença progride. Os LB são constituídos principalmente pela proteína alfa-sinucleína (aSyn), sendo esta a principal característica desta doença. A aSyn é uma proteína envolvida tanto nos casos de doença idiopática, como familiar da DP. Vários resíduos de aSyn são fosforilados quer na forma solúvel quer na forma agregada da proteína. Sendo que, aproximadamente 90% da aSyn presente nos agregados é fosforilada no resíduo serina 129 (S129), em contraste com apenas 4% de fosforilação neste resíduo em cérebros saudáveis. Apesar da fosforilação no resíduo S129 ser a mais bem estudada, pouco se compreende sobre o seu papel na doença. Por outro lado, estudos recentes realizados em culturas de células, em Drosophila e em cerébros humanos demonstraram a existência de fosforilação no resíduo tirosina 125 (Y125). Sabe-se que a fosforilação deste resíduo suprime a oligomerização. Para além disso, durante o envelhecimento, a fosforilação Y125 é naturalmente reduzida, sendo essa redução mais notável nos pacientes com DP. A falta de informação sobre a fosforilação no resíduo Y125 está relacionada com a dificuldade de detectar aSyn fosforilada neste resíduo em cérebros de humanos. Para além disso, é difícil estabelecer a ligação entre a progressão da doença e os níveis de aSyn fosforilados no resíduo de Y125. Devido a todas estas razões torna-se importante estudar o papel da fosforilação da aSyn nos resíduos S129 e Y125 na patogénese da DP. A levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é um organismo eucariota e unicelular versátil que apresenta uma organização intracelular complexa e cujas vias metabólicas são conservadas. Deste modo, este modelo é amplamente utilizado para compreender processos biológicos complexos encontrados em eucariotas superiores. S. cerevisiae é um modelo de estudo validado para a investigação da DP, sendo que já foi demonstrado que aSyn humana expressa em células de levedura induz toxicidade e formação de inclusões citoplasmáticas à semelhança do que foi observado noutros modelos biológicos, nomeadamente em modelos celulares de mamífero e em modelos animais de PD. Para além disso, existem várias vantagens para a utilização da levedura, como um organismo modelo, tais como a facilidade de manipulação em laboratório; o fato do seu genoma estar totalmente sequenciado; de apresentar um tempo de geração curto e também devido ao fato de ser possível manipular geneticamente através da aplicação simples de métodos clássicos de genética molecular. O principal objetivo do presente trabalho foi estudar o papel da fosforilação de aSyn na etiologia da DP, no que diz respeito ao efeito a nível de toxicidade e propensão para formar inclusões, utilizando como modelos S. cerevisiae e células humanas. Para isso, foram utilizadas três formas de aSyn: a forma selvagem (WT) e as formas não fosforiladas nos resíduos Y125 (Y125F) e S129 (S129A ou S129G), respetivamente. Observou-se que o bloqueio da fosforilação no resíduo Y125 (Y125F aSyn) diminui a percentagem de células com inclusões, enquanto, que o bloqueio da fosforilação no resíduo S129 (S129A aSyn ou S129G aSyn) aumenta a percentagem de células com inclusões. Em paralelo, observou-se que a mutação Y125F não altera a toxicidade da aSyn expressa na levedura S. cerevisiae enquanto, que a mutação S129G aumenta a toxicidade desta. Para validar os resultados em levedura, foi utilizado um modelo de agregação de aSyn, previamente descrito, numa linha celular humana de neuroglioma (H4). Neste modelo, a co-transfecção de uma forma modificada de aSyn (fundida a uma forma truncada de proteína verde fluorescente (GFP), e designada por SynT) juntamente com sinfilina-1, uma proteína neuronal também identificada nos LBs, resulta na formação de inclusões citoplasmáticas, as quais foram observadas através do método de imunocitoquimica. Utilizou-se este modelo estabelecido de agregação de aSyn para investigar o papel das mutações Y125F SynT e S129G SynT na formação de inclusões, em comparação com a situação controlo, WT SynT. Observou-se que as mutações Y125F SynT e S129G SynT resultaram no aumento do número de células com inclusões, o que indica que o bloqueio da fosforilação nos resíduos Y125 e S129 aumenta a propensão da aSyn para agregar no modelo de agregação H4. Além disso, observou-se que o padrão de formação de inclusões na mutação Y125F SynT era diferente do observado na WT SynT e S129G, apresentando agregados mais pequenos. Neste estudo mostrou-se que existem evidências de uma correlação entre fosforilação, agregação e toxicidade celular de aSyn usando o modelo simples, mas poderoso da levedura S. cerevisiae, e um modelo de células neurogliais humanas. Os resultados obtidos também contribuíram para a compreensão da base molecular da doença de Parkinson, tal como de outros distúrbios neurodegenerativos (isto é, outras sinucleionopatias, como, multiple system atrophy (MSA), pure autonomic failure (PAF), Doença de Lewy bodies). É importante referir que a forma não fosforiladado do resíduo Y125, neste caso, a mutação Y125F, deve ser considerada para estudos posteriores, pois obtivemos resultados diferentes quando se bloqueou a sua fosforilação quer em células de levedura quer em células neurogliais humanas. Isto pode significar que não há uma conservação de mecanismos entre espécies ou então que os resultados obtidos dependem do facto da sinfilina-1 não estar presente em levedura; será algo que terá interesse aprofundar. Também se pode explicar a discrepância de resultados com o facto de o modelo H4 se basear na co-expressão de sinfilina-1, uma proteína que não tem homologo em levedura mas quando expressa em levedura se sabe aumentar a propensão da aSyn para agregar. A fosforilação de Y125 aSyn, apesar de pouco conhecida e estudada considera-se muito importante, pois muitos estudos sugerem que uma alteração neste resíduo pode estar relacionada com a causa da doença neurodegenerativa e que pode ter uma influência negativa sobre a oligomerização, e consequentemente na agregação de aSyn. Por outro lado, a mutação S129G aSyn conduz ao aumento da formação de inclusões em levedura e a formação de inclusões nas células H4. Assim, concluímos que S129 é um resíduo que tem efeitos semelhantes nos dois modelos usados, sendo que provavelmente a sua fosforilação é um mecanismo conservado entre espécies. Seria de extremo interesse de futuro, estudar em mais detalhe as cinases e as fosfatases envolvidas na regulação da fosforilação deste resíduo. Em conjunto, estes novos resultados demonstram que diferentes resíduos fosforilados na aSyn resultam em diferentes níveis de agregação e toxicidade, sendo que os efeitos da fosforilação de S129 se mostraram indubitavelmente consistentes entre espécies. Por outro lado, a fosforilação de Y125 não apresentou essa mesma consistência. Uma explicação possível pode estar relacionada com o fato das cinases/fosfatases que regulam tirosinas em aSyn nas células humanas poderem não estar tão conservadas em células de levedura como as vias que fosforilam/desfosforilam serinas. Deste modo, torna-se interessante de futuro estudar os dois resíduos em simultâneo e verificar o que acontece quando os dois locais estão disponíveis ou não para serem fosforilados. O presente trabalho contribuiu para esclarecer o papel de uma modificação pós-traducional, a fosforilação, no processo de agregação de aSyn, no contexto da DP. Conhecer melhor estes mecanismos moleculares pode vir a permitir o desenvolvimento de novas estratégias para intervenção na DP, tal como noutras sinucleinopatias.
Alpha-synuclein (aSyn) is a protein involved in both idiopathic and familial Parkinson´s disease (PD) cases, being the major component of Lewy body inclusions (LBs), the typical pathological hallmark of this disorder. It is estimated that ~90% of the aggregated aSyn in LBs is phosphorylated in S129 residue, in contrast with only 4% of phosphorylation in the same residue in normal brain. Saccharomyces cerevisiae is a versatile eukaryotic organism that has being extensively used to understand the complex biological processes found in higher eukaryotes and it is a validated model in PD. Indeed, it has already been shown that aSyn induces toxicity and inclusion formation in a similar manner to that observed in other cell and animal model systems. The objective of this work was to study the role of phosphorylation of aSyn in the etiology of PD. For this, we used three forms of aSyn: wild shape (WT) and non-phosphorylated forms in the residues Y125 (Y125F) and S129 (S129A or S129G), respectively. We observed that blocking the phosphorylation at residue Y125 reduced the percentage of cells with foci while blocking the phosphorylation at residue S129 increased the percentage of cells with foci. In parallel, we observed that the Y125F mutation did not change the toxicity of aSyn expressed while the S129G mutation increased its toxicity. Subsequently, the aggregation resulting from the expression of Y125F aSyn and S129G aSyn was analyzed in the mammalian cell aggregation model based on co expression SynT and synphilin-1. Both mutations increased the formation of aSyn inclusions in those cells. Taken together, these new results provide an important insight into the role of phosphorylation in the aggregation process. A better understanding of these molecular mechanisms may enable the development of new strategies for intervention in PD and other synucleinopathies.
