Author(s): Almeida, Carlos Diogo Labão Alpiarça Sousa de
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/10668
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Ácido retinóico; Tropismo; Migração; Intestino; Sistema imunitário do intestino; Linfócitos intra-epiteliais; Células inatas linfóides; Teses de mestrado - 2013
Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013
A mucosa intestinal abriga uma vasta comunidade de microorganismos que contribuem para o normal funcionamento dos organismos superiores. Encontra-se dotada de um sistema imunitário que se compartimentaliza em diferentes estruturas linfóides que permitem a interacção com o meio exterior. O sistema imune intestinal contribui para a homeostase intestinal, tolerando os organismos comensais e definindo respostas inflamatórias contra patogénios. Num contexto homeostático, o estabelecimento de mecanismos que regulam o desenvolvimento de respostas imunes após interacção com um organismo ou antigénio desconhecido tornam-se indispensáveis. A influência de nutrientes no estabelecimento e regulação destas respostas tem vindo a ser demostrada nos últimos anos. Contudo, pouco ainda é conhecido sobre os mecanismos moleculares subjacentes à interacção entre nutrientes e as células imunes. A deficiência em vitamina A afecta aproximadamente 250 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo responsável por um grave aumento de morbidez a infecções gastrointestinais e respiratórias. O ácido retinóico (RA) é um metabolito da vitamina A que desempenha importantes funções no desenvolvimento do sistema imunitário e na regulação das respostas imunes. Uma resposta imunitária adequada requer a existência de mecanismos moleculares que permitam o rápido recrutamento de células imunes para combater o alastramento de uma infecção. Entre estes mecanismos inclui-se a aquisição da expressão de moléculas designadas por marcadores de residência que permitem o reconhecimento de sinais quimiotácticos e a retenção das células num determinado tecido. O receptor CCR9 e as integrinas α4β7 são os marcadores de residência mais importantes para o estabelecimento de células T na mucosa intestinal. Estudos anteriores relatam que o processo de aquisição da expressão de CCR9 e α4β7 é promovido por células dendríticas (DCs) CD103pos provenientes do intestino que metabolizam a vitamina A e fornecem RA a células T na periferia. Nas células T, o RA interage com receptores do ácido retinóico (RAR) desencadeando vias de sinalização que induzem a expressão de CCR9 e de α4β7. Os linfócitos intra-epiteliais (IELs) residem no epitélio e constituem a primeira linha de combate do sistema imunitário nas mucosas. Estes linfócitos caratecterizam-se em duas classes distintas: IELs não convencionais (ou naturais) - linfócitos T γδ e T αβ que expressam o homodímero CD8αα, e células T γδ que não expressam CD8 - e convencionais (ou induzidas) – compostas pelas células T CD4pos e CD8pos clássicas. Apesar da função do RA no recrutamento e estabelecimento de células T na lamina própria intestinal já ter sido demonstrada, pouco é sabido sobre o seu papel na função e migração dos IELs, como também sobre a própria dinâmica migracional destas células. Mais ainda, estas experiências foram realizadas através de dietas pobres em vitamina A, depletando o RA de forma promíscua. Por esta razão propusémo-nos a estudar o papel do RA na função e estabelecimento de células T no epitélio intestinal. Para tal, usámos ratinhos que possuem uma forma do RARα truncada após o aminoácido 403 (RARaT403) inserida no gene ubiquamente expresso ROSA-26, com um codão stop flanqueado por sequências loxP (ratinhos T403). O RARaT403 é incapaz de iniciar a cascata de sinalização a jusante do RARα e possui dominância negativa para com todas as isoformas do RAR. De forma a bloquear a sinalização do RA em células T, cruzámos estes ratinhos com outros que possuem um recombinase Cre, que reconhece sequências loxP, sob controlo do promotor do gene CD2 humano (ratinhos CD2cre T403). Os nossos resultados demonstram que uma deficiente sinalização de RA resulta numa forte diminuição do número de células T γδ, e de células T αβ CD8αα e CD8 αβ no epitélio, utilizando ratinhos com a expressão do RARaT403 em heterozigotia (CD2cre T403het). Observámos também uma diminuição de células T γδ, células T αβ e células inatas linfóides (ILCs) na lamina própria intestinal. A análise de timócitos durante o fluxo migratório de células T para o intestino, decorrente nas primeiras três semanas de vida do ratinho, apresentou uma acumulação de células T CD8pos no timo e diminuição de IELs não-convencionais no intestino. De forma a determinar se a diminuição observada seria causada por uma deficiente migração, baixa proliferação, ou por uma manutenção inefectiva, avaliámos o ciclo celular dos IELs e analisámos a expressão de CCR9 e de factores envolvidos na sobrevivência dos IELs em ratinhos CD2cre T403. Considerámos que o RA medeia o processo de migração de células T para o epitélio, atendendo à diminuição dos níveis de transcrito Ccr9 e à semelhante perfil de incorporação de BrdU em todas as populações de IELs de ratinhos CD2cre T403. Em reforço desta hipótese, os níveis de transcrito Ahr - fundamental para a sobrevivência das IELs – encontravam-se normais, e os níveis de Bcl2 e Bcl2l1 – proteínas anti-apoptóticas – estavam semelhantes ou sobre expressos em ratinhos CD2cre T403. De forma a compreender os mecanismos que regem a aquisição de tropismo em timócitos, determinámos a janela de tempo de desenvolvimento de células T em que o RA promove a aquisição de tropismo intestinal, recorrendo a ratinhos Rorc-cre T403het. Os nossos resultados sugerem que apenas em células T αβ não-convencionais, o tropismo é induzido após a fase DP (dupla positiva – timócitos que expressam CD8 e CD4). Deste modo, o nosso trabalho revela que a aquisição de tropismo em todos os IELs CD8pos deverá ocorrer no timo, e que o RA é imprescindível neste processo. Para além do papel do RA no recrutamento de células T para a periferia, demonstrámos também que o RA participa em processos de imunomodelação de IELs não-convencionais. Concretamente, a análise do perfil de citocinas de ratinhos com deficiente sinalização retinóide apresentou um aumento da percentagem de células produtoras de IL-17 em IELs γδ e αβ não convencionais comparativamente a ratinhos controlo. Por conseguinte, sugerimos que o RA poderá estar envolvido em mecanismos de regulação de respostas do tipo Th17 no epitélio. Por último, demonstrámos que o RA é crucial para a homeostasia de ILC3s na lamina própria intestinal. A análise de ratinhos CD2cre T403homo revelou uma diminuição dos números de ILC3s no intestino. Visto não terem sido encontradas diferenças em ratinhos CD2cre T403het, considerámos que o fenótipo depende da dose de RA. A análise de ratinhos Rorc-cre T403homo, onde a dominância negativa do mutante T403 é adquirida aquando a diferenciação das ILCs em ILC3s, apresentou uma dimuição das últimas. Por outro lado, a expressão de genes fundamentais para a sobrevivência das ILCs, bem como o ciclo celular e o número de ILCs em apoptose demonstraram ser semelhantes na ausência de sinalização retinóide. Neste sentido, sugerimos que o RA é fundamental para a diferenciação das ILCs, apesar de não contribuir para a sobrevivência e expansão após o seu desenvolvimento. Em contrapartida observámos que, nos mesmos ratinhos, os níveis de transcrito Rorc, que codifica para a proteína RORγt, se encontrava reduzido em ILC3s. Neste sentido, o nosso trabalho demonstra a importância do RA na manutenção da expressão de RORγt, principal regulador da diferenciação de ILCs em ILC3s. Em suma, os nossos resultados sugerem uma função imprescindível do ácido retinóico na regulação do sistema imunitário do intestino, em particular no imprinting de tropismo intestinal em células T não-convencionais no timo, e no desenvolvimento das ILCs.
Intraepithelial T lymphocytes (IELs) are key components of mucosal immunity, defining a frontline of defence against invasive microorganisms. However, the molecular mechanisms controlling IEL function and maintenance are still poorly defined. Retinoic acid (RA), a vitamin A metabolite, has been shown to mediate important processes in the immune system. Herein, we aimed to determine the role of retinoic acid signalling in the regulation of IEL development and establishment in the intestine. Remarkably, mice with deficient RA signalling in T cells exhibited significantly impaired lamina própria lymphocytes (LPL) and IEL pools. This was associated with the expression deficit of the gut-homing marker CCR9 in all IEL subsets while gene expression of a master regulator of IEL maintenance, Ahr, and their proliferative capacity was unaffected. Strikingly, monitoring of thymocytes during early gut colonization revealed that suboptimal RA signalling results in reduction of T cells in the gut and normal or increased T cells in the thymus. Moreover, we found that impairment of RA signalling at different thymic developmental stages impacts IEL subsets differently. Notably, we found evidence that RA signalling affects group 3 innate lymphoid cells (ILC3s) in a dose dependent manner, although it does not affect their maintenance or expansion. We also found that RA regulates Rorc gene expression and RORγt protein levels in ILC3s. Our findings illustrate that RA is an essential dietary component for normal development and function of the enteric immune system and unravel a putative function in thymic imprinting of gut-tropism to unconventional IELs.
