Gymnodinium catenatum strains isolated from the portuguese coast: physiological and genetic characterization

• Author(s): Silva, Teresa Lopes da, 1973-
• Date: 2013
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/10826
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Dinoflagelados; Toxinas; Marcadores genéticos; Portugal; Teses de mestrado - 2013
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Amorim, Ana, 1960-; Costa, Pedro Reis
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013

Gymnodinium catenatum is a toxic bloom forming dinoflagellate, which has been linked to paralytic shellfish poisoning (PSP) outbreaks in humans. Along the Portuguese coast (NE Atlantic), G. catenatum is ubiquitous but shows a complex bloom pattern, raising questions about the origin and affinities of each bloom population. Toxin and genetic signatures can discriminate phenotypic and genotypic variability among G. catenatum isolates from different geographical regions. In this work, the variability within six cultured strains of G. catenatum isolated from Portuguese coastal waters (S coast, W coast and NW coast), between 1999 and 2011, was investigated. The strains were analyzed for physiological parameters, such as growth patterns and toxin profiling and for intra-specific genetic diversity. Regarding the toxin profile, differences recorded between strains could not be assigned to the time of isolation or geographical origin. The parameter that most influenced the toxin profile was the life-cycle stage that originated the culture: vegetative cell versus hypnozygote (resting cyst). These differences were also registered for other physiological parameters such as growth curves and pigment profile. At the genetic level, all strains showed similar partial large subunit ribosomal DNA (D1-D2 LSU rDNA) sequences and shared up to 100% identity with strains from Spain, Algeria China and Australia. However, we did not find a total identity match for the ITS-5.8S rDNA fragment. After sequence analysis, a guanine/adenine single nucleotide polymorphism (SNP) was detected near the end of the ITS1 region, for all strains. G. catenatum has previously been reported to present very conservative LSU and ITS rDNA regions. These polymorphisms, not yet described, may represent a distinctive mark of the Portuguese population . Results obtained in the present work, show high homogeneity in toxin profile and at the genetic level for the analyzed strains. This may suggest an expansion of the North limit distribution of G. catenatum in the NE Atlantic rather than an anthropogenic introduction. In addition, we have applied for the first time DNA BOX-PCR fingerprinting to microalgae and found that it is a valuable taxonomic tool discriminating at the species level.

A occorência de proliferações de algas nocivas (HAB’s -harmuful algal blooms) nas zonas costeiras reveste-se de extrema importância pela ameaça que representam para a saúde pública e por serem a causa de consideráveis perdas económicas à escala mundial, para o sector das pescas, restauração e turismo. Gymnodinium catenatum é um dinoflagelado, que durante o seu ciclo de vida passa por uma fase de dormência (hipnozigoto), normalmente referida como quisto de resistência, que lhe permite sobreviver a condições adversas e desta forma contribuir para o reestabelecimento das populações vegetativas. Produz neurotoxinas, da família das saxitoxinas (STXs), tóxicas para alguns animais marinhos e para o homem. G. catenatum está descrito como uma das principais espécies de dinoflagelados responsáveis pela occorrência de episódios de intoxicação paralisante por ingestão de marisco (PSP-paralytic shellfish poisoning) nos humanos, que nos casos mais graves provoca morte por paralisia respiratória. Em Portugal e durante última a década, a proibição da apanha de marisco devido a PSTs (paralytic shellfish toxins) tem resultado exclusivamente da contaminação por esta espécie. As PSTs mais comuns são frequentemente divididas em três grupos com base na estrutura química da cadeia lateral que apresentem e no seu potencial de neurotoxicidade. Toxicidades superiores estão associadas ao grupo carbamato [STX, neosaxitoxina (NeoSTX) e gonyautoxinas (GTX 1-4)], seguidas pelas toxinas decarbamato (dcSTX, dcGTX1-4 e dcNeoSTX) e por fim o grupo sulfamato (N- sulfocarbamoílo), considerado o menos tóxico (C1, C2, C3, C4, GTX5 e GTX6). Em G. catenatum o perfil de toxinas é muitas vezes dominado pelastoxinas do grupo sulfamato. Devido à crescente consciencialização científica sobre a existência de microalgas com perfil tóxico, o conhecimento sobre a distribuição geográfica de G. catenatum, aumentou nos últimos anos e é hoje reportada nas águas costeiras de regiões temperadas de todos os continentes. Contudo, para além da sua distribuição biogeográfica natural, a distribuição actual de G. catenatum está associada à acção do homem como por exemplo, à dispersão da espécie pelo transporte de quistos de resistência nas águas de lastro dos navios. Desde os anos 80 que em Portugal, G. catenatum é descrito como a principal espécie produtora de PSTs. Esta problemática tem sido alvo de estudo por parte de várias entidades, de entre as quais o laboratório de referência para biotoxinas marinhas IPMA (Intituto Português do Mar e da Atmosfera), que reporta a recorrência intermitente, anual e decadal, de blooms de G. catenatum na nossa costa. Nos últimos anos o conhecimento sobre a ecologia e dinâmica destes episódios tem aumentado consideravelmente mas, ainda não foi possível compreender os mecanismos responsáveis pela variabilidade inter-anual e decadal observada. Embora se saiba que ao longo da costa Portuguesa (NE Atlântico) G. catenatum é ubíquo, o padrão complexo de blooms que é observado levanta questões sobre a origem e as afinidades das populações inóculo. Estudos sobre o registo fóssil de G. catenatum, indicam a colonização recente desta espécie na Península Ibérica, a partir do final do século XIX. Esta colonização recente foi inicialmente interpretada como uma possível evidência da introdução antropogénica de G. catenatum ao NE Atlântico. No entanto, trabalhos ulteriores indicam que a espécie já estava presente no Norte de África há pelo menos 3000 anos e sugerem que a colonização da Península Ibérica se deve à expansão natural do limite Norte de distribuição da espécie. Estas duas rotas de introdução originariam, presumivelmente, populações regionais com diferentes níveis de diversidade intra-específica. A primeira hipótese originaria uma população Ibérica com maior variabilidade, dada a sua origem em várias regiões geográficas, enquanto que a segunda geraria uma população de menor variabilidade intra-específica. Um dos aspectos ainda por analisar em populações de G. catenatum da costa Portuguesa é o da variabilidade intra-específica. É sabido que a análise do perfil de toxinas e o uso de marcadores genéticos podem servir para discriminar a variabilidade fenotípica e genotípica existente entre isolados de G. catenatum de diferentes regiões geográficas. Neste sentido, no presente trabalho investigámos a variabilidade fisiológica, padrões de crescimento e perfis de toxinas, e a variabilidade genética. de 6 culturas de G. catenatum obtidas a partir de isolados colhidos em diferentes locais da costa Portuguesa (costa S, costa W e costa NW), entre 1999 e 2011. Estudámos dois tipos de culturas, umas provenientes do isolamento e germinação em laboratório de quistos de resistência e outras resultantes de células vegetativas planctónicas isoladas da natureza. No que diz respeito aos resultados obtidos para os perfis de toxinas, as diferenças verificadas entre as estirpes não podem ser atribuídas à sua origem geográfica ou data de isolamento. A análise dos resultados evidencia que o perfil de toxinas é sobretudo condicionado pela fase do ciclo de vida que originou a cultura: célula vegetativa versus hipnozigoto (quisto de resistência). Esta evidência também foi registada noutros parâmetros fisiológicos, tais como nas curvas de crescimento e no perfil de pigmentos das estirpes. Estes resultados parecem sugerir que a expressão de alguns caracteres fisiológicos em G. catenatum depende de factores ambientais que não são reprodutíveis em laboratorio. Não obstante, o padrão de toxinas evidenciado pelas estirpes que derivaram da germinação de quistos, enquadram-se com o que já foi descrito para a costa NE do Atlântico (Portugal e Espanha) e que é caracterizado pela produção mais abundante de C1-4, GTX5 e GTX6 e valores baixos de dcSTX. Curiosamente as estirpes resultantes do isolamento de células vegetativas mostraram perfis de toxinas diferentes dos anteriormente descritos com valores muito superiores de dcSTX, ausência de C3+4 e GTX6 e presença de dcGTX2+3. Ao nível genético, todas as esirpes evidenciaram sequências parciais idênticas no ADN ribossomico (ADNr) que codifica a subunidade maior do ribossoma (LSU-Large Sub-Unit). Em relação ao fragmento da LSU analisado (D1-D2), as nossas estirpes partilharam sequências idênticas com estirpes do GeneBank de Espanha, Argélia, China e Austrália. No entanto, para uma outra região do mesmo ADNr – região ITS-5.8S – a identidade genética entre as estirpes não foi total. Após a análise de sequências, foi detetado um polimorfismo no final da região ITS1, com uma sobreposição guanina/adenina. De acordo com trabalhos anteriores, G. catenatum apresenta regiões LSU e ITS-5.8S muito conservadas, pelo que este polimorfismo, ainda não descrito por outros autores, poderá vir a revelar-se um marcador das populações de G. catenatum da costa Portuguesa e da Península Ibérica. Os resultados obtidos mostram que as populações de G. catenatum que ocorrem na costa Portuguesa são bastante semelhantes em relação ao perfil de toxinas e à assinatura genética. Esta observação sugere que a introdução da espécie em águas Ibéricas tenha ocorrido a partir de uma mesma população e não a partir de múltiplas introduções com possível origem em populações geográficas diferentes, como se esperaria se a introdução fosse via águas de lastro de navios. Nesse sentido, este trabalho suporta a teoria mais recente que aponta para a colonização da Península Ibérica ter ocorrido em resultado da expansão do limite Norte de distribuição da espécie no Atlântico NE. Ainda no que respeita à análise de ADN, aplicámos neste trabalho pela primeira vez a técnica do BOX-PCR a microlagas, organismos unicelulares eucariotas. Esta técnica de análise do ADN total, tem sido apenas usada em bactérias e fungos. Os resultados indicam que em dinoflagelados esta técnica não permite descriminar a variabilidade intra-específica, no entanto, verificamos que poderá vir a constituir uma ferramenta valiosa em estudos taxonómicos de microlagas permitindo a discriminação ao nível de espécie.