Author(s): Ferreira, Ricardo José Diogo Grácio
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/11208
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Project/scholarship: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/3599-PPCDT/PTDC%2FQUI-QUI%2F099815%2F2008/PT;
Subject(s): Diterpenos macrocíclicos; Glicoproteína-P; Farmacóforo; Multi-resistência; Química computacional; Dinâmica molecular; Teses de mestrado - 2011
Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011
O cancro é actualmente uma das doenças com maior prevalência, constituindo um dos maiores desafios da Medicina no século actual. Apesar dos avanços no tratamento médico e farmacológico algumas formas mais agressivas de cancro desenvolvem resistência a múltiplos fármaco (multi-resistência, ou MDR), muitas vezes relacionada com o aumento da expressão da Glicoproteína-P (P-gp) à superfície das células cancerígenas. A expressão aumentada deste transportador contribui para o fracasso dos tratamentos farmacológicos, fazendo com que o desenvolvimento de moduladores (também conhecidos como reversores da multi-resistência ou inibidores) seja uma das estratégias mais promissoras no combate a este fenómeno. A P-gp é uma proteína transmembranar da família dos transportadores ABC, identificado na MDR desde a década de 1970. Vários estudos demonstraram que a inibição desta bomba de efluxo em particular poderia reverter o fenómeno de resistência a múltiplos fármacos em linhas celulares resistentes a múltiplos fármacos. Devido à ubiquidade dos substratos transportados e à ausência de uma estrutura cristalográfica da P-gp até 2009, o desenvolvimento de moduladores foi severamente comprometida, permitindo no entanto o desenvolvimento e publicação de estudos focando o desenvolvimento de farmacóforos, contribuindo para uma melhor compreensão das principais características necessárias para uma modulação eficaz da sua actividade. No entanto, a maioria dos farmacóforos publicados foram desenvolvidos a partir de moléculas com uma variação estrutural limitada, não sendo capazes de detectar moduladores obtidas a partir da espécies do género Euphorbia pelo grupo de Produtos Naturais, sob coordenação do Prof. Maria José U. Ferreira. Desde 2009 que se encontra disponível no Protein Data Bank estruturas cristalográficas da P-gp murina, homóloga da P-gp humana em 89% da sua estrutura. Devido à enorme homologia entre as duas proteínas, são de uma importância fulcral na realização de estudos de homologia, evitando muitos dos problemas detectados por estudos anteriores que utilizaram como modelo transportadores bacterianos. No entanto, a baixa resolução da estrutura e a ausência de um importante segmento intermédio não permite a sua utilização directa. Através do recurso a técnicas de simulação computacional, a sequência em falta pode ser modelada e inserida na estrutura, permitindo a avaliação da estrutura completa em termos de estabilidade estrutural e acerca da importância do ambiente hidrofóbico no mecanismo de acção do transportador. A partir de farmacóforos e dados disponíveis na literatura e com base em diterpenos macrocíclicos isolados a partir de espécies do género Euphorbia, foi efectuado um estudo das características farmacofóricas mais importantes, tendo sido obtido um novo e melhorado farmacóforo de quatro pontos que permite a detecção de um espectro mais amplo de moduladores, mantendo uma elevada precisão na detecção de moléculas sem actividade. Foi determinada a importância dos grupos hidrofóbicos e aceitadores de pontes de hidrogénio como características essenciais para o reconhecimento de diferentes moléculas pela P-gp, bem como a combinação de diferentes características e a sua influência na taxa de detecção e os estados de protonação dos grupos amina. Com os estudos de dinâmica molecular, e através da utilização de diferentes metodologias e campos de força, foi possível obter uma estrutura final equilibrada e novos dados relevantes acerca da importância da membrana lipídica e da sequência cristalográfica omissa, contribuindo desta forma para uma melhor compreensão da estrutura deste tipo de transportador.
Cancer is one of the most prevalent and challenging diseases in the current century. Despite the advances in medical and in pharmacological treatment, some types of cancer develop multidrug resistance, often related to the increased expression of P-glycoprotein (P-gp) by cancer cells, thus contributing for the failure of chemotherapeutic treatments, making the development of P-gp modulators (also known as MDR reversers, inhibitors or chemosensitizers) one of the most promising strategies to overcome MDR. P-gp is a member of ABC transporters that is known since 1970's. Several studies demonstrated that the inhibition of this particular efflux pump could reverse the multidrug phenomenon in multidrug resistant cell lines. Due to the ubiquity of the transported substrates and to the absence of a crystallographic structure until 2009, the development of modulators was severely impaired, which allowed the publication of studies focusing the development of pharmacophores, therefore contributing to a better understanding of the key features needed to a successful modulation of the P-gp activity. However, most of the published pharmacophores were developed from molecules with limited structural variation, not being able to detect modulators obtained in-house from Euphorbia species by the Natural Products group, under coordination of Prof. Maria José U. Ferreira. Since 2009 that is available in the Protein Data Bank the crystallographic structure of murine P-gp. This structure shares a a 89% similarity with human P-pg and is suitable for homology modeling studies, avoiding some of the problems faced by previous studies that were based in bacterial transporters and later proved inaccurate. Nevertheless, the low resolution of the structure and the absence of an important intermediate segment does not allow the use of the data in subsequent studies. Through computational simulation, the missing sequence can be constructed and inserted in the structure and the complete transporter can be evaluated, regarding the stability of the secondary structure and the importance of the lipid environment in the transporters mechanism of action. Based on pharmacophores and data already published and focusing in macrocyclic diterpenes isolated from Euphorbia species, a comprehensive study on pharmacophore features was performed, obtaining a new and improved four-point pharmacophore able to detect a broader spectrum of modulators, but simultaneously specific enough to avoid the detection of non-active molecules. It is clarified the importance of the hydrophobic and electron acceptor moieties as essential features for recognition of different molecules by the P-gp drug-binding site, also accessing the best combination of the different pharmacophoric moieties and evaluating the amine groups protonation states. Regarding the computational studies, through the utilization of different methodologies and comparing the results in several force fields, some final and equilibrated structures could be obtained, providing new data on the importance of the lipid bilayer and the missing crystallographic sequence and contributing to the better understanding of the structure for this type of transporter.
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