Author(s): Pinto, Mariana Nogueira
Date: 2014
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/12380
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Radiofármacos; Complexos de TC(I) e Re(I); Péptidos biológicamente activos; Antagonista da bombesina; Teses de mestrado - 2014
Tese de mestrado em Química Tecnológica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014
O desenvolvimento de Radiofármacos específicos capazes de detectar e/ou tratar neoplasias continua a ser uma das mais importantes áreas de investigação, uma vez que o cancro tem grandes taxas de incidência na população mundial. A utilização de péptidos biologicamente activos é uma estratégia para direccionar os radiofármacos aos tumores de uma forma específica, já que os receptores que os reconhecem estão sobre-expressos numa grande variedade de tumores. A introdução dos precursores organometálicos fac-[M(H2O)3(CO)3]+ (M=Re, 99mTc) permitiu explorar novas metodologias na marcação de péptidos com radioisótopos de Tc ou Re, com base numa química bem definida e facilmente adaptável a diferentes estratégias de bioconjugação. Apesar desta vantagem, o uso de complexos de tricarbonilo de Tc(I)/Re(I) na marcação de péptidos tem conduzido a radiopéptidos com uma farmacocinética pouco favorável. Mais do que uma limitação intrínseca da aproximação tricarbonilo, esta tendência reflecte a utilização de ligandos bifuncionais (LBF) que originam péptidos radiomarcados com caracter lipofílico, com uma excreção hepatobiliar indesejável. Assim, a concepção de novos LBF para marcação de péptidos com a unidade fac-[M(CO)3]+ ainda se reveste de grande importância de modo a aproveitar a elevada estabilidade in vitro/in vivo dos complexos tricarbonilo. Nesta tese, estudou-se a utilidade e influência de diferentes LBF tridentados na radiometalação de péptidos, com base na aproximação tricarbonilo. O péptido avaliado é um análogo de um Antagonista da Bombesina designado por AR. Este péptido é reconhecido pelos receptores do péptido libertador da Gastrina (GRP-r; Gastrin releasing peptide-receptor), sobreexpressos em vários cancros, nomeadamente no cancro da próstata. Neste contexto, o objetivo a longo prazo do trabalho descrito nesta tese foi contribuir para a concepção de novos radiofármacos específicos baseados em [99mTc(CO)3]+ para a visualização in vivo dos receptores da GRP, nomeadamente nas neoplasias da próstata. Para alcançar este objetivo, foram sintetizados três quelantes bifuncionais diferentes e caracterizados pelas técnicas usuais em química, incluindo ESI-MS, RMN e HPLC, tendo sido posteriormente conjugados ao AR. Os ligandos bifuncionais estudados contêm pirazolilo (L1 e L2) e imidazolilo (L3) como grupos coordenantes e têm o mesmo número e tipo de átomos coordenantes (N,N,N). Esperava-se que conduzissem a complexos estáveis de Re(I)/Tc(I), cuja farmacocinética fosse facilmente optimizada por introdução de grupos hidrofílicos nos anéis de pirazolilo e imidazolilo. Os dois LBF derivados do pirazolilo que foram estudados contêm espaçadores diferentes entre o grupo carboxílico terminal a usar para ligação ao péptido e a amina central do ligando: L1 contém um braço do tipo propilo e o L2 um braço metilo. Desta forma, esperava-se avaliar a influência da distância do péptido biologicamente activo ao centro metálico no perfil biocinético dos radioconjugados resultantes. O L1 é um quelante do tipo pirazolilo que já se encontra bastante estudado pelo Grupo de Ciências Radiofarmacêuticas (C2TN-IST) e tem excelentes propriedades de coordenação face ao centro metálico tricarbonilo, bem como fácil conjugação a biomoléculas, nomeadamente a péptidos. Foi avaliada a capacidade de coordenação de um novo ligando (L5), contendo um grupo coordenante do tipo imidazolilo, face à unidade [M(CO)3]+(M = Re, 99mTc). No caso do 99mTc, este estudo conduziu a um complexo hidrofílico que foi obtido com rendimento e pureza radioquímica elevados. Este complexo apresenta ainda uma elevada estabilidade in vitro e in vivo e estudos de biodistribuição em ratinho mostraram que tem um perfil biocinético favorável. Assim, concluimos que este ligando tem características favoráveis para conjugação com péptidos biologicamente activos. Os análogos peptidicos sintetizados basearam-se na seguinte sequência: DPhe1-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Sta8-Leu9-NH2 (AR), a qual foi acoplada a um espaçador de polietilinoglicol (PEG) por forma a aumentar a distância entre o centro metálico e a BM e conferir um carácter mais hidrofílico aos conjugados. Para a síntese destes péptidos foi utilizada a estratégia de síntese em fase sólida (resina) e aminoácidos protegidos com o grupo protector Fmoc. Após cada síntese e/ou conjugação a derivados dos ligandos L1-L3, os péptidos e conjugados peptídicos (AR, ARPEG2, L4, L6 e L7) foram purificados e caracterizados por ESI-MS e HPLC. No caso do conjugado peptídico L4, resultante da conjugação de ARPEG2 a um derivado de L1, iniciou-se o estudo da sua radiomarcação com 99mTc. São necessários mais estudos para melhorar as condições de marcação e continuar com os necessários estudos de captação celular em células tumorais de cancro da próstata e de biodistribuição e farmacocinética em ratinhos com tumores induzidos. Esses estudos deverão ser alargados aos restantes bioconjugados de modo a investigar quais são os mais promissores para a concepção de novos radiofármacos para detecção de cancro da próstata.
The development of radiopharmaceuticals for imaging/therapy of cancer remains an important issue. Biologically active peptides are used as specific carriers for the targeting of tumors, as many peptide receptors are overexpressed in tumors. The organometallic precursors fac-[M(H2O)3(CO)3]+ (M=Re, 99mTc) allow the labeling of peptides based on a well-defined and easily adaptable chemistry. However, the resulting complexes are often lipophilic and show unfavorable pharmacokinetics. Improving this issue is still crucial, which requires the design of new BFC’s (bifunctional chelator) for coordination of fac-[M(CO)3]+ and aiming to obtain radiopeptides with more favorable in vivo profile. In this context, the goal of this thesis was to contribute for the development of radiopharmaceuticals based on [99mTc(CO)3]+ for in vivo imaging of tumors overexpressing the Gastrin Releasing Peptide-receptor (GRP-r,), particularly prostate cancer. To accomplish this goal, three different BFC’s were synthesized, characterized and conjugated to a bombesin antagonist peptide, with known ability to target GRP-r. The investigated BFC's contain pyrazolyl (L1, L2) and imidazolyl (L3) coordinating groups and can lead to hydrophilic complexes of Re(I)/Tc(I). Pyrazolyl-diamine chelators like L1 and L2 are known to have excellent properties to stabilize the [M(CO)3]+ core.On contrary, imidazolyl-diamine chelators like L3 were not explored so far. Therefore, a model imidazolyl-diamine ligand, L5, was synthesized its coordination capacity towards the [99mTc(CO)3]+ evaluated. L5 forms a hydrophilic complex, in high radiochemical yield and purity, which presents high stability in vitro/in vivo and a favorable biokinetic profile. The synthesized peptide analogs were based on the following sequence: DPhe1-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Sta8-Leu9-NH2 (AR). A spacer of polyethyleglycol (PEG) was conjugated to AR, to impart a more hydrophilic character. For the synthesis of peptides, a solid phase (resin) and Fmoc strategy were used. These studies led to the synthesis of several peptide conjugates (AR, ARPEG2 and L4). It was inititated the study of the radiolabeling of L4 with[99mTc(CO)3]+. This preliminary results indicated that more studies are needed to improve the labeling and proceed with the evaluation of cellular uptake and biodistribution/pharmacokinetics in mice with induced prostate tumors.
