Novo sistema two-hybrid bacteriano baseado na manipulação da degradação protegida

• Author(s): Oliveira, Soraia Rafaela Santiago de
• Date: 2007
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/1352
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Microbiologia molecular; Imunologia bacteriana; Teses de mestrado
• Document Type: Master thesis
• Language: Portuguese
• Advisor(s): Gonçalves, João; Correia, Maria do Céu
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular e Genética), 2007, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

A expressão de anticorpos intracelulares em eucariotas apresenta um enorme potencial na genómica funcional e na terapia génica. Métodos como o phage display e os sistemas two-hybrid permitem a selecção de anticorpos intracelulares com elevada afinidade e especificidade contra um dado antigénio. Contudo, nestes métodos a orientação espacial do anticorpo face ao antigénio encontra-se comprometida, dado que o anticorpo se encontra em fusão com uma outra proteína. Assim, torna-se importante desenvolver um novo método, em que o anticorpo possa ser expresso sem estar ligado a outra proteína, ou seja, um método que permita a selecção de anticorpos específicos contra um antigénio, sem que haja interferência da orientação espacial do anticorpo. Nesta dissertação de mestrado é apresentado um novo sistema two-hybrid, em que a via de degradação ClpXP é manipulada, no sentido de ser possível detectar fortes interacções proteína-proteína (como por exemplo, interacções entre anticorpo e antigénio). Neste sistema, o antigénio é expresso em fusão com um repressor (proteína Arc do fago P22) e o anticorpo em fusão com um sinal de degradação (DAS+4). Também é assegurada a expressão simultânea da proteína SspB (stringent starvation protein B) por indução com arabinose. Se ocorrer interacção entre o anticorpo e o antigénio, a proteína SspB reconhece o sinal e encaminha o complexo Arcantigénio- anticorpo-DAS+4 para degradação. Como resultado, o repressor Arc, em fusão com o antigénio, deixa de reprimir um promotor que regula a resistência ao cloranfenicol e a bactéria, onde essa interacção ocorreu, torna-se resistente ao cloranfenicol. O trabalho experimental realizado permitiu confirmar esta interacção e o método apresentado pode ser considerado como um bom sistema para isolar anticorpos intracelulares com elevada afinidade, especificidade e estabilidade

The expression of intrabodies [intracellular antibodies (Ab)] in eukaryotes presents an enormous potential in functional genomics and therapeutics. Methods as phage display and two-hybrid systems allow us to select intrabodies with great affinity and specificity against an antigen (Ag). However, in these methods the spatial orientation of the Ab facing an Ag is compromised, since the Ab is fused to another protein. Thus, it is essential to develop a new method where the Ab can be expressed without being attached to a protein, one that allows the selection of good binders against an Ag without the interference of the Ab spatial orientation. Here, we present a novel bacterial two-hybrid system where the degradation pathway ClpXP is manipulated in order to detect strong protein-protein interactions (eg. Ab- Ag). In this system, we express an Ag in fusion with a repressor (Arc of P22 Phage) and an Ab with a degradation tag (DAS+4). At the same time we induce (with arabinose) the expression of the SspB protein (stringent starvation protein B). If there is an interaction between the Ab and Ag, then SspB recognizes the sinal and leads the complex Ab-Ag for degradation. As a result, the Ag-trans-inhibitor protein no longer represses the promoter that regulates the resistance to chloramphenicol and the bacteria where the Ab-Ag interaction occurred becomes resistant to the chloramphenicol. In our experiments we have confirmed this interaction and we can envision this method as a potent system to isolate intrabodies with high affinity, specificity and stability