Quantificação de ADN nuclear e ADN mitocondrial por PCR em tempo real

• Author(s): Oliveira, Ana Rita Ramalho de
• Date: 2009
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/1425
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Biologia molecular; Ciência forense; Marcadores genéticos; Teses de mestrado
• Document Type: Master thesis
• Language: Portuguese
• Advisor(s): Geada, Helena; Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Humana e Ambiente), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

A obtenção do perfil genético é comummente efectuada através de ADN nuclear, recorrendo a vários marcadores, em especial aos STRs. Embora toda a análise forense de ADN seja muito robusta e baseada em tecnologias muito fiáveis, amostras muito degradadas ou com quantidades limitantes de ADN são frequentes e podem afectar o êxito da análise. Nestes casos, a análise do ADN mitocondrial pode ser muito valiosa devido ao elevado número de cópias existentes por célula. A quantificação de ADN nuclear e ADN mitocondrial é um procedimento importante para o sucesso da determinação de perfis genéticos, que deve ser efectuado, previamente, a qualquer análise de ADN. No Serviço de Genética e Biologia Forense, da Delegação do Sul do Instituto Nacional de Medicina Legal, I.P., foram realizados os estudos conducentes à validação interna de dois procedimentos de ensaio - o procedimento de ensaio para quantificação de ADN nuclear pelo kit Quantifiler Human DNA Quantification e o procedimento de ensaio para quantificação de ADN mitocondrial por um protocolo elaborado. Estes estudos foram realizados de acordo com as orientações designadas no Procedimento Geral de Validação de Procedimentos de Ensaios, estabelecido pelo Serviço. Os parâmetros estudados para a validação de ambas as metodologias foram os seguintes: precisão, limiares analíticos, especificidade e contaminação. Relativamente à metodologia da quantificação de ADN nuclear, este estudo demonstrou a grande precisão e reprodutibilidade dos resultados obtidos, assim como a capacidade de detecção e quantificação de amostras com concentrações até 16pg/µl de ADN nuclear. Foi demonstrada a especificidade para o ADN humano, não se verificando alterações no desempenho do kit na presença de ADN exógeno. Foi elaborado um protocolo de trabalho do método de quantificação de ADNmt humano por PCR em tempo real, baseado na tecnologia Taqman® por amplificação de um fragmento de 113 pares de base da região HV1, para o qual foi foram, também, realizados os estudos conducentes à validação desta metodologia. O estudo demonstrou uma consistência e estabilidade nos resultados obtidos indicando que o método de quantificação de ADN mitocondrial é preciso e QUANTIFICAÇÃO DE ADN NUCLEAR E ADN MITOCONDRIAL POR PCR EM TEMPO REAL Resumo v apresenta reprodutibilidade, permitindo a detecção e quantificação de amostras com 165 cópias de genomas mitocondriais por µl. Foi demonstrada a especificidade humana da metodologia, não havendo alterações no desempenho em presença de ADN estranho. Foi realizada, também, a avaliação da aplicação e o impacto dos dois procedimentos na rotina do Laboratório, verificando-se que a quantificação de ADN nuclear e mitocondrial é importante no procedimento laboratorial para os subsequentes estudos de ADN

Obtaining the genetic profile is commonly done by nuclear DNA, using several markers, especially STRs. Although all the forensic DNA analysis is very robust and highly reliable, degraded samples or with limiting amounts of DNA are common and can affect the success of the analysis. In these cases, mitochondrial DNA analysis can be very valuable because of the large number of existing copies per cell. The quantification of nuclear DNA and mitochondrial DNA is an important procedure for the successful determination of genetic profiles, which must be made prior to any DNA analysis in the laboratory. In the Genetics and Forensic Biology Department of the National Institute of Legal Medicine South Branch, studies were made leading to the internal validation of two analytical procedures the analytical procedure for nuclear DNA quantification by the Quantifiler Human DNA Quantification kit and the analytical procedure for mitochondrial DNA quantification by a new protocol. These studies were conducted in accordance with the guidelines designated in the General Procedure for the Validation of Analytical Procedures established by the Department Validation parameters for both methods were: precision, sensitivity, specificity and contamination. Concerning nuclear DNA quantification, this study demonstrated the high accuracy and reproducibility of results which detected as little as 16pg/µl of nuclear DNA. Highly specificity for human DNA was detected and there were no changes in the performance of the kit in the presence of exogenous DNA. A protocol was established for human mtDNA quantification by real-time PCR based on Taqman ® technology for amplification of a 113 base pair fragment within the HV1 region for further implementation in forensic casework Studies leading to the validation of this methodology were also conducted. This study demonstrated precision and stability in the results indicating that mitochondrial DNA quantification method is accurate and reproducible, allowing the detection and quantification of samples down to 165 copies of mitochondrial QUANTIFICAÇÃO DE ADN NUCLEAR E ADN MITOCONDRIAL POR PCR EM TEMPO REAL Abstract vii genomes. High specificity for human DNA and no change in performance in the presence of foreign DNA were also detected. Forensic implications have been evaluated for both methods, showing that quantification of nuclear and mitochondrial DNA is important in the laboratory procedure for subsequent DNA studies