Study of cilia assembly in Tetrahymena and the role of cytosolic chaperonin CCT

• Author(s): Seixas, Ana Cecília Fernandes, 1974-
• Date: 2008
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/1533
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Biologia molecular; Teses de doutoramento
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Soares, Maria Helena Antunes; Gomes, Rui Artur Paiva Loureiro, 1958-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Molecular), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2008

Os cílios são organelos conservados evolutivamente que são requeridos num vasto número de processos celulares tais como locomoção, quimiotaxia, movimento de fluídos e transdução de sinais. Nos últimos anos, um grande número de publicações tem demonstrado o impacto que pequenas alterações no correcto funcionamento dos cílios tem no Homem. Várias doenças humanas que se caracterizam por quadros clínicos complexos, como o síndrome de Bardet-Biedl (BBS) e o síndrome de Meckel-Gruber (MKS) foram relacionadas como directamente causadas por alterações pontuais de componentes do cílio. O número deste tipo de patologias que afectam o Homem, designadas porciliopatias, tem crescido continuamente. Isto é facilmente compreendido se tivermos em conta que o cílio é uma estrutura bastante mais complexa do que inicialmente se admitia, estimando-se através dos mais recentes estudos proteómicos o envolvimento de aproximadamente 400 proteínas, e várias dessas ainda desconhecidas. A maior parte do conhecimento obtido até à data na área da ciliogénese centra-se sobre o papel das proteínas estruturais do cílio, que participam na montagem da estrutura do axonema ou ligando os diferentes componentes deste. Assim sendo, muitas proteínas encontradas nos cílios, quer seja no espaço citoplasmático' do cílio como no próprio axonema, tem um papel ainda desconhecido. De igual modo, o processo da ciliogénese ainda é mal conhecido, particularmente entre o passo de ancoragem do corpo basal à superfície da célula e a formação de um cílio completo. Neste trabalho, estudámos o processo da ciliogénese no ciliado eucariota Tetrahymena utilizando microscopia de força atómica (AFM). Para tal, os cílios das células foram removidos, e a diferentes tempos de reciliação foram colhidas amostras de células que sem qualquer tratamento, foram observadas por AFM. Por comparação com os dados já publicados de trabalhos semelhantes mas obtidos por microscopia electrónica, verificou-se que os cílios foram cortados ao nível da região de transição do cílio, ao nível da estrutura fibrosa de padrão estrelado. Os resultados obtidos sugerem que a ciliogénese compreende dois mecanismos que ocorrem sequencialmente, sendo o primeiro deles baseados na adição de material de grandes dimensões (Capítulo II). Este material apareceu associado lateralmente ao cílio em regeneração e parece ser composto por 3 unidades de dimensões, forma e rigidez idênticas. Baseados nas observações feitas, sugerimos que este material é previamente montado no corpo celular ou junto à base do cílio sendo utilizado na montagem do cílio. A utilização destes blocos estruturais é exclusiva do primeiro mecanismo que compreende a ciliogénese, durante o qual é montado o primeiro micrómetro do cílio (tendo um cílio maduro cerca de 7 micrómetros). Aparentemente, uma vez que o cílio possui as estruturas designadas de capacete ( cap ) na sua extremidade distal, a ciliogénese não é mais dependente destas unidades pré-montadas. Supomos que uma vez que o cap do cílio exista, a incorporação destas unidades pré-montadas deve ser impedida e o processo de ciliogenése muda de mecanismo. A partir desse momento não observámos mais nenhum material nas paredes dos cílios, sugerindo que a ciliogenése prossegue pela adição de material de dimensões mais discretas, não detectáveis com o AFM.ii Uma das classes de proteínas presentes no cílio e das quais pouco se sabe sobre o seu papel no cílio são as chaperones moleculares. Trabalho previamente realizado no laboratório mostrou a presença no cílio maduro e em regeneração de algumas subunidades da chaperonina citosólica CCT. Colocou-se então a hipótese de que as chaperones poderiam manter a conformação funcional nativa dos componentes ciliares, até eles serem introduzidos na estrutura ciliar. Note-se que a incorporação das subunidades de tubulina e diversos componentes ciliares é feita na extremidade distal, pelo que devem ser transportados do local da sua síntese (corpo celular) até à extremidade distal do cilío. De forma a investigarmos o papel das subunidades de CCT_ e CCT_ no cílio, foram criadas estirpes de Tetrahymena deletadas para as respectivas subunidades (Capítulo III, parte A). Os resultados mostram que ambas as subunidades são essenciais para a sobrevivência da célula. Mais importante, no contexto do nosso objectivo de estudo, notámos que as extremidades distais dos cílios se apresentavam danificadas. A extremidade do cílio encontrava-se bifurcada, ficando uma das partes do cílio na forma de um arco caído para um lado. Quando analisado por microscopia de imunofluorescência com um anticorpo anti-tubulina observámos que a parte em forma de arco era mais estreita que a outra e terminava com duas marcações intensas na forma de círculos. Comparando dados da literatura de microscopia electrónica, interpretámos que se trata da parte do cílio que é composto pelo par central de microtúbulos e as suas respectivas projeções terminando no cap central. Note-se que em Tetrahymena é sabido que o cap é composto por duas partes, uma cobrindo e ligando-se especificamente ao par central, sendo a outra o cap dos dupletos de microtúbulos. Para além disso, verificou-se que os cílios das células depletadas em CCT_ e CCT_ eram mais curtos que os cílios de células controlo, sugerindo um aumento da taxa de despolimerização dos microtúbulos dos cílios quando estes tem níveis deficientes de CCT_ e CCT_. No sentido de obter mais dados sobre o papel das subunidades de CCT, introduzimos em células depletadas para CCT_ um fragmento de ADN codificando para CCT_-HA, sob o controle de um promotor indutível dependente de cadmio. Conseguimos com esta estirpe e imitar uma situação de Knockdown de CCT_ que nos confirmou a autenticidade do fénotipo observado para a depleção de CCT_. A depleção parcial trouxe a vantagem de as células poderem assegurar as funções vitais da chaperonina CCT enquanto entidade responsável pela aquisição da estrutura tridimensional correcta. Foi assim possível perceber que a subunidade de CCT tem um papel importante na manuteneção da integridade da extremidade do cílio e no controle do comprimento do cílio (Capítulo III, Parte A).Transversalmente ao nosso interesse em estudar o papel de CCT_ e CCT_ no cílio, no decorrer das experiências de recuperação das células depletadas nas subunidades referidas, detectámos a capacidade das células transferirem ADN de um macronúcleo (o macronúcleo velho ) para outro (o macronúcleo novo ). Este processo de transferência de ADN para o locus de CCT_ e CCT_ respectivamente ocorria quando estirpes heterocarióticas para a deleção do gene eram colocadas em conjugação de modo a obter células de Tetrahymena depletadas de CCT_ e CCT_ (Capítulo III, Parte B). Mais, percebemos que as partículas de ouro usadas para bombardear as células provavelmente actuam como meio de veículo do ADN e por isso são responsáveis pela capacidade das células recuperarem o ADN do macronúcleo velho e incorporarem o cromossoma de interesse no novo macronúcleo das células exconjugantes. Este resultado constitui o primeiro registo em que este fenómeno pode ocorrer em locus de genes essenciais em Tetrahymena. No sentido de investigar possíveis defeitos ciliares que pudessem elucidar o papel das subunidades de CCT no cílio, e tirando proveito das células depletadas em CCT_ e CCT_, transformámos estas estirpes com ADN no qual introduzimos respectivamente mutações aleatoriamente e específicas (Capítulo IV e V, respectivamente).No caso da mutagénese de CCT_, obtivemos um mutante com um fenótipo complexo, com células de diferentes formas celulares cuja fenótipo se interpretou ser devido a uma diferente dose de allelos contendo a mutação (Capítulo IV). Para além disso, as células mutantes apresentavam uma falta de coordenação total entre os eventos nucleares e corticais que caracterizam a divisão binária em Tetrahymena. Consequentemente, o mutante denominado EMSD1 apresentava várias hipotéticas células que se mantiveram unidas numa massa única por incapacidade de completarem a sua citocinése e que sofreram regressão citoplasmática. Curiosamente, esse mutante revelou uma mutação silenciosa num exão e um nível de CCT_ superior ao nível fisiológico, cuja relação deverá ser esclarecida no futuro. No caso da mutagénese de CCT_, escolhemos reproduzir uma mutação num aminoacido conservado entre CCT_ e a proteína BBS6 que se sabe ter evoluido do CCT_ e ser uma protéina que participa na ciliogénese. Obtivemos um mutante sensível á temperatura com cílios visivelmente afectados pela mutação introduzida. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese apontam para um papel das subunidades de CCT_ e CCT_ ao nível da manutenção da integridade da extremidade mais distante do cílio. É razoável sugerir com base nos resultados obtidos que as proteínas CCT_ e CCT_ deverão ter um papel activo na estrutura do cap do cílio, com consequências na manutenção do equílibrio entre polimerização e despolimerização dos microtúbulos do cílio.

Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT, SFRH/BD/5176/2001)