Chestnut blight in Portugal : spread and populational structure of Cryphonectria parasitica

• Author(s): Bragança, Maria Helena Pires, 1964-
• Date: 2007
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/1535
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Microbiologia; Teses de doutoramento
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Tenreiro, Rogério Paulo de Andrade, 1955-; Rigling, Daniel
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de doutoramento em Biologia (Microbiologia), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2008

Cryphonectria parasitica, the causal agent of chestnut blight, has been considered one of the most important mortality factors of the sweet chestnut Castanea sativa all over the world. To evaluate the current distribution of chestnut blight in Portugal, all chestnut growing regions across the entire country were screened, a total of 191 chestnut stands were surveyed and C. parasitica was isolated from 56.5% of the sampling sites. The factors involved in the spread and incidence of the disease were studied for one of the most important chestnut areas in the country, located on Trás-os-Montes e Alto Douro. Selected variables were altitude, soil type, diameter at breast height (DBH), location and orientation of cankers in the tree. The highest proportion of canker was found in trees with a DHB above 30 cm, and a higher proportion of cankers was found on the South-facing side of the trunks and branches. In order to improve the knowledge about C. parasitica diversity, a total of 617 isolates from all affected chestnut growing areas were analyzed. Nine vegetative compatibility (vc) types were identified among the isolates. EU-11 was the most widespread vc type comprising 80.2% of the isolates, followed by EU-12 (7.1%) and EU-66 (6.6%). Two of the Portuguese vc types could not be assigned to a known European vc type. The diversity of vc types was low in the Portuguese populations of C. parasitica, but comparable to other areas where C. parasitica has been recently introduced. The frequent occurrence of perithecia and both mating types of C. parasitica indicates that sexual reproduction of the chestnut blight fungus is common in Portugal. One C. parasitica isolate from Trás-os-Montes showed white culture morphology and contained dsRNA indicating the presence of hypovirulence in this area. During this study atypical isolates, strongly related with C. parasitica, were found among common isolates. To allocate these unreported isolates to the correct taxon, they were compared to known C. parasitica and C. radicalis isolates using an integrated approach comprising morphological and molecular methods. Phylogenetic analyses show that these isolates are grouped in a separate clade from C. radicalis sensu stricto (phylotype I), but together with other isolates considered as C. radicalis, thus allowing their identification as C. radicalis phylotype II. Genomic fingerprinting of isolates was performed with microsatellite-primed PCR and diagnostic molecular markers, suitable for the discrimination of C. radicalis phylotype I, C. radicalis phylotype II and C. parasitica, were obtained with (GACA)4 primer.

Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr é o agente causal da doença conhecida como cancro do castanheiro. Esta doença foi identificada pela primeira vez em castanheiro americano, Castanea dentata, nos Estados Unidos da América em 1904 e dizimou quase totalmente os castanheiros americanos nos 40 anos que se seguiram.A doença foi descoberta na Europa em 1938, embora o fungo tenha sido descrito pela primeira vez em Portugal em 1929 a partir de amostras de castanheiro Japonês, Castanea crenata. Depois da detecção inicial, apenas em 1989 foram encontrados dois focos da doença em castanheiro Europeu, Castanea sativa, na região de Trás-os-Montes e Alto Douro. Durante algum tempo esta doença ficou associada quase exclusivamente ao nordeste do país. Na Europa a doença não teve a mesma repercussão que nos Estados Unidos devido ao inesperado aparecimento de fenómenos de hipovirulência transmissível, um fenómeno de controlo biológico natural que, juntamente com a maior tolerância do hospedeiro na Europa, contribuiu para evitar o desaparecimento global dos castanheiros inicialmente sujeitos a fortes surtos de mortalidade. As primeiras formas atípicas do fungo foram isoladas a partir de cancros em regressão, apresentavam virulência reduzida quando inoculadas em castanheiros e, quando co-inoculadas com as estirpes normais, a maioria dos cancros resultantes entrava em compartimentação. O aparecimento da hipovirulência resultou na recuperação de muitos povoamentos de castanheiro europeus. Os indivíduos portadores do hipovirus transferem o dsRNA viral através de anastomoses hifais, conferindo a outros características de hipovirulência. A incompatibilidade vegetativa entre indivíduos afecta a transmissão de hipovirulência e, consequentemente, afecta o controlo biológico natural do cancro do castanheiro, sendo a probabilidade de transmissão dos hipovirus uma função do número de diferentes genes de incompatibilidade vegetativa. A incompatibilidade vegetativa é controlada por interacções entre alelos (duas estirpes são incompatíveis quando têm diferentes alelos em um ou mais vic-loci), sendo que na Europa é controlada por 6 vicloci, cada um com dois alelos, tendo os 64 genótipos possíveis sido identificados e atribuídos a diferentes tipos de compatibilidade vegetativa (cv). A reduzida diversidade em grupos cv parece estar directamente relacionada com o potencial de sucesso dos programas de controlo biológico. Uma vez que a transmissão se faz mais rapidamente entre estirpes do mesmo tipo, a introdução de estirpes hipovirulentas só deve ser feita após conhecimento profundo da diversidade de grupos cv existentes em cada local, de forma a não comprometer o sucesso das acções de controlo biológico. Por outro lado, a transmissão vertical destes hipovirus está limitada a conídios, esporos de produção assexuada, não ocorrendo em ascósporos. Este facto, associado à geração de novos tipos cv por recombinação meiótica, torna a reprodução sexuada um dos maiores obstáculos à dispersão da hipovirulência. Tendo C. parasitica um sistema misto de cruzamento, com auto-fertilização e heterotalismo com dois tipos conjugais (MAT-1 e MAT-2), a análise das proporções destes e a avaliação da diversidade genómica permite identificar os mecanismos de reprodução prevalentes (assexuada versus sexuada) e caracterizar a estrutura das populações de C. parasitica, fornecendo informações essenciais para a planificação de estratégias de luta biológica. Com este trabalho pretendeu-se em primeiro lugar fazer um reconhecimento da distribuição actual do cancro do castanheiro em Portugal (continente e Regiões Autónomas da Madeira e Açores), tendo sido com esse objectivo implementado um trabalho de prospecção a nível nacional. Foram prospectadas 191 parcelas de castanheiro em todo o país e verificou-se a presença de C. parasitica em 56,5% das amostras (108 parcelas). As parcelas amostradas foram digitalmente georeferenciadas e cartografadas. Uma colecção de isolados de C. parasitica foi estabelecida, constituindo uma base uma base de trabalho para os estudos posteriores. Com o objectivo de avaliar os factores que poderiam estar envolvidos na dispersão e incidência da doença, foi escolhida a Região Demarcada da Padrela em Trás-os-Montes, por ser uma zona do país importante do ponto de vista de área de castanheiro e produção de castanha e onde se verificavam muitos registos da ocorrência da doença. Na área de estudo foram prospectadas 32 parcelas, distribuídas por 4 freguesias do concelho de Valpaços, e elaboradas fichas de caracterização geral para cada parcela e árvores observadas. Foram analisadas variáveis associadas à parcela (altitude, tipo de solo, orientação) e às árvores (localização predominante dos cancros, orientação predominante dos cancros, diâmetro à altura do peito - DAP). A incidência da doença foi estimada em 40% para a área de estudo, verificando-se uma maior incidência de cancro nos ramos e nas árvores cujo DAP era superior a 30 cm, havendo uma tendência para uma maior predominância de cancros do lado sul da árvore. Não se verificou correlação entre os restantes factores analisados e o aparecimento de cancro na zona de estudo. Para avaliação da diversidade genética de C. parasitica foram analisados 617 isolados provenientes de todas as regiões do país. Foram efectuadas confrontações entre toda as culturas recolhidas, tendo-se encontrado nove tipos diferentes de compatibilidade vegetativa. Culturas representantes de cada um dos nove tipos cv foram posteriormente confrontadas com culturas representativas dos tipos já estabelecidos na Europa. Concluiu-se que o tipo cv mais frequente em Portugal é o tipo europeu EU-11 (80,2% dos isolados testados pertenciam a este tipo), estando este amplamente disseminado por todo o país. O tipo cv europeu EU-12 foi encontrado em 7,1% dos isolados portugueses e o tipo cv EU-66 em 6,6%. Dois dos nove tipos cv encontrados não mostraram compatibilidade com nenhum dos Europeus, pelo que se consideram ser dois novos tipos. Os resultados deste trabalho permitem assim afirmar que temos no país uma diversidade genética ainda baixa (índice de diversidade variando entre 0,146 e 1,209), comparativamente com outros países da Europa onde a doença já se estabeleceu há mais tempo (França, Suiça, Itália), sendo os valores comparáveis com os dos países onde a introdução da doença ainda é recente (Eslováquia, Macedónia, Turquia, Alemanha). Através da projecção que foi efectuada com base nos tipos cv encontrados em Portugal, constatou-se a existência de um potencial genético que promoverá uma maior diversidade genética no futuro. De facto, assumindo a recombinação dos vic loci conhecidos, o número de tipos cv poderá atingir 32 e será certamente mais elevado se houver introdução de outros tipos cv através de entrada no país de material vegetal contaminado. A ocorrência de peritecas (estruturas de frutificação sexuada) em muitas regiões, assim como a existência dos dois tipos conjugais (MAT-1 e MAT-2) com proporções idênticas, indica que a reprodução sexual do fungo é um fenómeno frequente em Portugal. Foi confirmada a presença de dsRNA viral num isolado, proveniente de Trás-os- Montes. A associação da baixa diversidade vegetativa, encontrada actualmente no país, com a existência de hipovirulência natural será um factor importante para o controlo da doença em Portugal. Sendo o dsRNA viral mais facilmente transmitido entre indivíduos pertencentes ao mesmo tipo cv, o facto do isolado hipovirulento pertencer ao tipo mais comum (EU-11) faz prever que estarão reunidas condições para uma dispersão facilitada da hipovirulência. Porém, se a baixa diversidade é um factor positivo, por outro lado a evidência de uma alta incidência de reprodução sexuada em Portugal é um factor negativo, uma vez que os ascósporos não permitem a transmissão do hipovirus e a recombinação sexual aumentará a diversidade genética. Com o conhecimento da distribuição da doença e depois dos estudos genéticos efectuados no âmbito deste trabalho, está disponibilizado conhecimento que faculta o entendimento da dinâmica da doença em Portugal e constitui a base necessária para a implementação segura de programas experimentais de luta biológica no nosso país. Durante este estudo obtiveram-se ainda culturas atípicas entre os isolados de C. parasitica, verificando-se posteriormente que esses isolados revelavam as mesmas características morfológicas de isolados anteriormente recolhidos em sobreiro e classificados como Endothiella gyrosa. Para a sua correcta identificação, estes isolados foram comparados com isolados de C. parasitica e de C. radicalis, sendo esta uma espécie do mesmo género que partilha os mesmos hospedeiros, mas que é considerada saprófita. Para a identificação foram utilizados de uma forma integrada métodos morfológicos e moleculares, que permitiram identificar estes isolados como pertencendo à espécie C. radicalis filotipo II. As análises filogenéticas separaram este filotipo II do filotipo I, considerado por alguns autores como C. radicalis sensu stricto. Verificou-se com a técnica de MSP-PCR uma clara separação dos três grupos analisados, C. parasitica, C. radicalis filotipo I e C. radicalis filotipo II, tendo sido definidos marcadores moleculares, através da utilização do primer (GACA)4,, para distinguir de uma forma rápida isolados pertencentes a estes grupos de fungos.