Estudo da fragmentação do DNA em espermatozoides humanos após separação por MACS

• Author(s): Bucar, Sara Ventura, 1991-
• Date: 2014
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/15464
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Biologia do desenvolvimento; Apoptose; Infertilidade masculina; Teses de mestrado - 2014
• Document Type: Master thesis
• Language: Portuguese
• Advisor(s): Sá, Rosália; Rodrigues, Maria Gabriela, 1965-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

O espermograma é uma ferramenta fundamental no diagnóstico da infertilidade masculina. Neste exame são avaliados diversos parâmetros dos espermatozoides, como a concentração, motilidade, morfologia, vitalidade e integridade da membrana. Contudo, o espermograma não avalia a integridade do DNA dos espermatozoides, e danos nesta estrutura têm sido relacionados a falhas nos tratamentos de Reprodução Medicamente Assistida (RMA). Com o objetivo de isolar espermatozoides livres de danos no DNA, a técnica Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) foi aplicada para complementar as técnicas clássicas de preparação dos espermatozoides para RMA. No presente trabalho foram processadas 100 amostras de sémen de acordo com diferentes combinações de MACS e técnicas de preparação dos espermatozoides clássicas, incluindo a centrifugação por gradientes de densidade (DGC) e o swim-up (SU). O objetivo consistiu em verificar se, após os protocolos aplicados, ocorria uma diminuição significativa do número de espermatozoides com fragmentação do DNA (sDNAfrag), e determinar qual o protocolo mais eficiente nessa redução. Os resultados obtidos mostraram que todos os grupos apresentaram uma redução significativa da sDNAfrag, com a maior taxa de redução (83,3 ± 15,4%) a verificar-se com o protocolo MACS-DGC-SU. Com este protocolo, verificou-se que pacientes com valores diminuídos para a motilidade progressiva, vitalidade e integridade da membrana dos espermatozoides alcançaram uma maior redução de sDNAfrag. Além disso, pacientes com valores abaixo dos valores de referência para a motilidade progressiva rápida, ou para a motilidade progressiva rápida e morfologia normal, obtiveram também uma maior redução de sDNAfrag do que pacientes com valores abaixo dos valores de referência para a morfologia normal. Tendo em conta estes resultados, a técnica MACS demonstra potencial para otimizar a taxa de redução de sDNAfrag, quando aplicada antes da DGC e do SU, especialmente em amostras de sémen cujos espermatozoides apresentem motilidade progressiva, vitalidade e integridade da membrana diminuídas.

Spermiogram analysis is a fundamental tool in the diagnosis of male infertility that evaluates several sperm parameters such as concentration, motility, morphology, vitality and membrane integrity. However, it does not evaluate sperm DNA integrity and sperm DNA injuries have been related to Assisted Reproduction Treatment failures. To isolate sperm without DNA damage, Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) was employed as an adjunct of the classic sperm preparation techniques. In the present study 100 semen samples were processed according to different combinations of MACS with other classic sperm preparation techniques that included density gradient centrifugation (DGC) and swim-up (SU) methods. The aim of the study was to evaluate whether there was a significant decrease in the number of sperm with fragmented DNA (sDNAfrag) after the protocol applied and verify which protocol was the most efficient in reducing sDNAfrag. The results showed that all groups presented a significant decrease in sDNAfrag, with the highest reduction rate (83.3 ± 15.4%) being obtained with the protocol MACS-DGC-SU. With this protocol, patients with worst values in the semen regarding sperm progressive motility, vitality and membrane integrity achieved the best sDNAfrag reduction. Moreover, patients whose semen presented values above the reference for rapid progressive motility, or rapid progressive motility and normal morphology, showed a higher sDNAfrag reduction rate than patients with values above the reference value for normal morphology. Based on the results obtained, MACS showed potential to optimize the sDNAfrag reduction rate when applied before DGC and SU, especially in semen samples with low progressive motility, vitality and membrane integrity.