Author(s): Quaresma, Cláudia Cristina Valente, 1986-
Date: 2014
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/15705
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Artrite reumatóide; Doenças auto-imunes; Marcadores celulares; Teses de mestrado - 2014
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune crónica, sistémica e de etiologia desconhecida, que afeta cerca de 0,5-1% da população mundial. A AR é caracterizada por uma poliartrite simétrica associada a dor e tumefação de múltiplas articulações, em particular das pequenas articulações das mãos. Embora não exista ainda cura para a AR, sabe-se que um tratamento adequado, assim como um diagnóstico precoce são de extrema importância para o doente e para a sociedade em geral. Se não for corretamente tratada, a AR conduz a destruição óssea e articular. Deste modo, é crucial que a terapêutica seja a mais adequada possível ao estado clínico do doente e implementada na fase inicial do curso da doença. O tratamento da AR tem como principais objetivos a preservação da função e qualidade de vida do doente, minimizando a dor e sinais inflamatórios, a remissão e controlo das manifestações sistémicas. Os primeiros tratamentos administrados aos doentes com AR são drogas anti-inflamatórias não esteróides e corticóides, úteis no alívio dos sintomas clínicos e na diminuição da inflamação. Contudo, torna-se primordial o uso de drogas antirreumáticas modificadoras da doença como, por exemplo, o metotrexato (MTX), eficaz no controlo da atividade e progressão da doença. Todavia, a introdução das terapias biológicas como as drogas anti-fator de necrose tumoral (anti-TNF) ou o anticorpo monoclonal bloqueador do recetor da interleucina-6 (IL-6R) tocilizumab (TCZ), possibilitou atingir uma melhoria considerável na inibição da progressão da doença. Várias doenças autoimunes são dependentes de células B, principalmente através da produção de autoanticorpos, tal como a AR. Estudos anteriores revelaram a importância das células B na patogénese da AR através de diversos mecanismos. As células B produzem autoanticorpos, como o fator reumatoide (FR) e anticorpos anti-proteínas citrulinadas (ACPA), que formam complexos imunes que se depositam nas articulações, causando inflamação. Além disso, as células B podem funcionar como células apresentadoras de antigénio e ativar células T, sendo também capazes de produzir citocinas uma vez ativadas e participar na organização de estruturas linfóides secundárias. A descoberta da eficácia da terapêutica de depleção de células B com rituximab (RTX) trouxe não só melhorias na qualidade de vida dos doentes, como também veio reforçar a posição-chave destas células nesta doença autoimune. O principal objetivo deste trabalho foi a caracterização das subpopulações de células B no sangue periférico de doentes com AR em fase inicial, sem terapêutica e em doentes com AR estabelecida. Adicionalmente, de forma a analisar as possíveis influências do tratamento no desenvolvimento dos processos imunológicos mediados pelas células B na evolução da AR, foi também comparado o efeito dos diversos tratamentos (MTX, anti-TNF e TCZ) no fenótipo das células B e na produção de citocinas e quimiciocinas diretamente relacionadas com a ativação de células B na AR. Para tal, foram incluídos neste estudo, um grupo de doentes com poliartrite não tratada (n=13) com menos de 1 ano de duração da doença, os quais foram classificados como AR iniciais (ERA). Foram também analisados doentes com AR estabelecida sob terapêutica com MTX (MTX, n=17) e MTX pré-biológico (MTX pre-bio, n=29). Dentro do grupo MTX pre-bio, foi realizada uma segunda colheita de sangue em doentes com AR oito meses após terem iniciado tratamento com anti-TNF (n=10) ou TCZ (n=7). A análise da frequência das subpopulações das células B no sangue periférico foi efetuada usando o sistema de classificação IgD/ CD27 que permite a identificação das principais quatro subpopulações de células B (CD19+): naïve (IgD+CD27-), pre-switch-memory (IgD+CD27+), post-switch memory (IgD-CD27+) e double-negative (DN, IgD-CD27-). De forma a poder identificar e caracterizar a subpopulação de plasmócitos no sangue periférico, foi usado o sistema de classificação IgD/ CD38, que identifica os plasmócitos como IgD-CD38++, dentro da região das células B CD19+. Neste estudo não foram observadas diferenças nas células B totais (CD19+) nos doentes com AR em comparação com os controlos saudáveis. Contudo, quando analisadas as subpopulações de células B, foram observadas alterações nas células B de memória em circulação, nomeadamente um aumento da subpopulação de células B de memória DN (IgD-CD27-) nos doentes com AR estabelecida tratados com MTX e MTX pré-biológico, em relação aos controlos saudáveis. De modo a caracterizar o fenótipo das células B na fase inicial e estabelecida da AR, foram estudados vários marcadores celulares diretamente relacionados com a ativação e sobrevivência de células B (BAFF-R, TACI e BCMA), ativação celular (HLA-DR, CD69 e CD86), ativação mediada pelo recetor de células B (IgM), diferenciação (CD5), quimiotaxia das células B (CXCR5), apoptose mediada pelo complexo Fas (CD95) e ativação mediada pelo Toll-like receptor 9 (TLR9), através da análise da intensidade média da fluorescência (MFI). Adicionalmente, foram quantificados no soro de todos os grupos analisados os níveis de CXCL13, uma quimiocina importante para as células B, e o CD23 solúvel (sCD23), envolvido na maturação das células B. O BAFF, uma citocina fundamental na sobrevivência das células B, tem sido sugerida como potencial alvo terapêutico para doenças autoimunes dependentes de células B, como a AR. Esta citocina apresenta 3 recetores: BAFF-R, TACI e BCMA. Neste estudo observou-se um aumento da MFI do TACI em doentes com AR estabelecida sob terapêutica com anti-TNF, em particular na subpopulação de células B post-switch memory. Nos restantes recetores do BAFF não foram encontradas diferenças significativas em comparação com os controlos saudáveis. O recetor TACI tem uma função ambígua, pois pode funcionar como recetor de ativação e/ ou de inibição das células B. É possível que o tratamento com anti-TNF induza um aumento da expressão de TACI nas células B de modo a inibir a sua ativação e o desenvolvimento da autoimunidade. Estudos anteriores têm evidenciado que as células B, uma vez ativadas, aumentam a expressão de marcadores de ativação como o HLA-DR, CD69 e CD86. Neste trabalho, embora não tenham sido observadas diferenças na MFI do CD69 e CD86 nas subpopulações de células B analisadas nos grupos de doentes em comparação com os controlos saudáveis, foi encontrado um aumento significativo na MFI do HLA-DR em doentes com AR estabelecida sob terapêutica com anti-TNF e TCZ. Estudos anteriores demonstraram que as terapêuticas com anti-TNF e TCZ diminuem a infiltração celular observada na membrana sinovial dos doentes com AR. É possível que, devido ao efeito da terapêutica, as células B ativadas que infiltram as articulações regressem ao sangue periférico, justificando deste modo o aumento da MFI do HLA-DR. Foi também observada uma diminuição da MFI do CD86 nos doentes com AR estabelecida tratados com anti-TNF e TCZ em comparação com as colheitas baseline, o que sugere uma inibição da ativação das células B induzida pelo tratamento com imunosupressores. A apoptose por meio do recetor de morte celular Fas (CD95) desempenha um papel central na manutenção da auto-tolerância imunológica periférica. De facto, alterações nesta via de apoptose foram demonstradas na patogénese de doenças autoimunes como a AR. Neste estudo, valores aumentados de MFI do CD95 foram observados nas células B de memória post-switch em doentes com AR estabelecida após o tratamento com anti-TNF e TCZ quando comparados com controlos saudáveis, o que poderá ser uma consequência direta do tratamento como forma de neutralizar a ativação de células B autoreativas. Estudos efetuados na AR e noutras doenças autoimunes têm revelado alterações nas células B CD5+. Estas células estão associadas à reabsorção óssea através da produção de IL-6, uma citocina que estimula a diferenciação de osteoclastos, as células responsáveis pela erosão óssea. Este marcador também tem sido sugerido como um regulador negativo da ativação de células B. Neste trabalho foi encontrada uma diminuição significativa da frequência de células B CD5+ em todos os grupos de doentes com AR estudados, em comparação com controlos saudáveis. A diminuição da frequência destas células em circulação em todos os grupos de doentes poderá ser resultante do recrutamento de células B CD5+ para a membrana sinovial, onde ocorre o principal processo inflamatório na AR, o que poderá contribuir para a erosão óssea. Além disso, foram observados aumentos dos valores de MFI do CD5 em doentes com AR estabelecida sob terapêutica com anti-TNF e TCZ, que poderão estar relacionados com a função inibitória deste marcador na ativação das células B. A estimulação de células B através de TLRs também pode ser um mecanismo diretamente relacionado com autoimunidade. O TLR9, em particular, tem sido associado ao desenvolvimento da AR. Sabe-se que a associação do BCR e TLR9 pode ativar as células B autoreativas que reconhecem o DNA CpG endógeno libertado a partir de células apoptóticas e o DNA-CpG IgG dos complexos imunes nas articulações com AR, e induzir a transformação das células B em plasmócitos produtores do FR. Neste estudo, a expressão aumentada de TLR9 foi observada em todas as subpopulações de células B nos doentes com AR estabelecida após o tratamento com TCZ quando comparados com os controlos saudáveis. Além disso, foram observados aumentos nos valores de MFI do TLR9 nas células B post-switch memory e células DN em doentes tratados com MTX em comparação com os controlos saudáveis. Estas observações sugerem que as células B podem ter mecanismos alternativos para perpetuar a autoimunidade, através da ativação mediada pelo TLR9. O CXCR5 é um recetor de quimiocina expresso nas células B de recirculação. Este recetor de quimiocina e o seu ligando, CXCL13, estão envolvidos na quimiotaxia de células B, estando regulados positivamente no líquido sinovial dos doentes com AR. Neste estudo, foi observado um aumento dos níveis de expressão (MFI) do CXCR5 nas células B e um aumento dos níveis séricos de CXCL13 em doentes com AR quando comparados com controlos saudáveis, o que pode indicar uma regulação positiva da quimiotaxia de células B na AR e o seu recrutamento para os locais de inflamação, como as articulações. Durante a ativação de células B, o CD23 membranar (mCD23) é clivado por uma protease associada à célula e libertado como CD23 solúvel (sCD23). Níveis aumentados de sCD23 foram encontrados em doentes com AR, os quais estão diretamente relacionados com a erosão das articulações. Neste estudo, o aumento dos níveis séricos de sCD23 detetados em doentes ERA não tratados em comparação com os controlos saudáveis, poderá indicar uma ativação precoce das células B desde a fase inicial da doença. Em conclusão, os resultados desta tese suportam a existência de alterações nas células B de memória em circulação na fase estabelecida da AR. Além disso, os níveis de expressão de marcadores celulares podem ser afetados pelos tratamentos com anti-TNF e TCZ, nomeadamente marcadores de ativação (HLA-DR, CD86). Doentes na fase inicial da doença, sem terapêutica apresentam diminuições significativas nas frequências de células B CD5+, expressão elevada de CXCR5 e níveis elevados de CXCL13 e sCD23 no soro em comparação com os controlos saudáveis, o que suporta a hipótese da ativação das células B e o seu envolvimento na patogénese e desenvolvimento da AR desde a fase inicial da doença.
Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic inflammatory autoimmune disease characterized by chronic pain and progressive joint damage. The etiology of RA is unknown and the disease prevalence in the adult population is 0.5-1% worldwide. If left untreated, RA leads to joint destruction, functional disability, comorbidity and reduced life expectancy. Different effector pathways and cells are involved in the cascade of events leading to the progression and persistence of the disease. B cells play critical roles in RA physiopathology through diverse mechanisms. B cells produce autoantibodies such as rheumatoid factor (RF) and anti-citrullinated protein antibodies (ACPA), which form immune complexes that deposit in the joints, causing inflammation. Additionally, B cells can function as antigen presenting cells and activate T cells; release cytokines once activated and participate in ectopic lymphoid organogenesis. The main goal of this work was to characterize B cell subpopulations in the peripheral blood from untreated early rheumatoid arthritis (ERA) patients and established treated RA patients. A full characterization of peripheral blood B cell subpopulations, serum cytokine and chemokine environment was performed. It was found that established RA patients have disturbances in the frequencies of memory B cell subpopulations in circulation, namely a significant increase in double negative IgD-CD27- B cells. Also, the expression levels of cellular markers can be affected by TNF inhibitors and TCZ treatment, particularly activation markers (HLA-DR, CD86). Furthermore, untreated ERA patients have significantly decreased frequencies of CD5+ B cells, elevated CXCR5 expression and higher serum CXCL13 and sCD23 levels in comparison with controls, which support an early B cell activation in RA pathogenesis. In conclusion, alterations in the mechanisms associated with B cells’ physiopathology are observed since early RA that might be modulated by treatment with TNF inhibitors and TCZ at later stages of the disease.
