Author(s): Moura, Pedro Luís Vaz Belo, 1992-
Date: 2015
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/19868
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Peste suína africana; Vírus - peste suína africana; Interferão; Teses de mestrado - 2015
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
The African Swine Fever Virus (ASFV) is a cytoplasmically replicating DNA virus transmitted by ticks, which causes a highly contagious and frequently fatal disease in domestic pigs. ASFV pathogenesis is typified by extensive haemorrhage and lymphoid apoptosis, with an associated tropism for macrophages. Viral spread is inhibited through the impact of interferon secreted from the early infected cells, which stimulates the expression of interferon stimulated genes (ISGs) that confer the development of an anti-viral state to resist viral replication in both infected and nearby non-infected cells. In order to survive in macrophages, the ASFV must have evolved multiple genes for evasion and manipulation of interferon. Toll-like Receptors (TLRs) are particularly important in the induction of the innate immune response. This, and the fact that the virus is adapted to survive in both vertebrate and invertebrate hosts, with only innate immunity being common to both, stimulated us to search for and identify a TLR antagonist in the ASFV genome, I329L. The ASFV I329L ORF was interestingly predicted to be a type I transmembrane protein containing two leucine-rich repeats (LRRs) in its extracellular domain and a barely detectable homology with the TLR3 intracellular TIR domain, raising the possibility that I329L might inhibit activation of IFN-β through an inhibitory interaction with the TIR motif of the TLRs and the corresponding downstream signaling adaptor proteins. This structural homology correlated with luciferase reporter assays which clearly demonstrated that I329L inhibits TLR3-mediated activation of NF-kB and IRF3, therefore inhibiting production of IFN-β. Thus, this work attempted to clarify the mechanisms by which I329L is able to inhibit the TLR3 signalling pathways. We have determined that I329L has evolved two distinct strategies for inhibition of TLR3: the extracellular domain interferes with dimerization of TLR3 and other TLRs, perhaps through the formation of non-signaling heterodimers, while the intracellular domain directly interacts with TRIF (a signaling protein downstream of TLR3), inhibiting signal transmission.
O vírus da Peste suína africana (VPSA) é um vírus pertencente ao grupo dos Vírus nucleocitoplasmáticos de DNA com grandes dimensões, com genoma de DNA de cadeia dupla, cápside com simetria icosaédrica e involucrado; é o único vírus de DXA transmitido por um vector artrópode, sendo o agente etiológico da peste suína africana, uma doença extremamente contagiosa e de elevada mortalidade no porco doméstico que é caracterizada por extensas hemorragias e apoptose dos tecidos linfóides. Estes sintomas não se verificam nos hospedeiros naturais do VPSA (carraça, javali e porco selvagem africano), em que causa apenas uma infecção permanente e assintomática. A propagação do vírus é inibida graças ao efeito do interferão secretado por células recém infectadas, que estimula por sua vez a expressão de genes estimulados por interferão; estes genes levam á entrada da célula num estado anti-viral, que inibe a replicação viraI de forma autócrina (por alteração/paragem dos mecanismos basais celulares) e parácrina (por secreção de moléculas que induzem o mesmo efeito nas células vizinhas). Os receptores do tipo Toll são considerados como pertencentes à imunidade inata devido à sua capacidade de reconhecer uma extensa variedade de moléculas associadas à infecção por patogénios, inexistentes na célula em condições regulares (p.ex., peptidoglicano da parede celular bacteriana, lipopolissacáridos da membrana externa de bactérias Gram-negativas ou RNA de cadeia dupla). Após reconhecimento deste tipo de moléculas, estes receptores homodimerizam e induzem a produção de citocinas/quimiocinas e/ou interferão, induzindo o estado anti-viral previamente mencionado. Os receptores do tipo Toll existem apenas em vertebrados, mas são semelhantes aos receptores Toll existentes em invertebrados; assim, a resposta imune induzida pelos receptores do tipo Toll e pelos receptores Toll não é idêntica, mas tem a mesma origem evolutiva. Em particular, o receptor de tipo Toll número 3 (TLR3) dimeriza e induz sinalização através dos factores de transcrição IRF-3 e NF-kB após reconhecimento de RNA de cadeia dupla. O RNA de cadeia dupla existe na célula pontualmente graças aos mecanismos de interferência de RNA, sendo detectado e destruído de imediato; no entanto, RNA de cadeia dupla de grandes dimensões tende a não existir na célula, e portanto é uma indicação de infecção viral. Vírus de genoma de RNA de cadeia dupla ou RNA de sentido negativo produzem RNA de cadeia dupla constitutivamente, mas os vírus de DNA (aos quais pertence o VPSA) podem produzir moléculas de RNA de cadeia dupla por transcrição convergente; assim, a infecção por um destes tipos de vírus induz sinalização pelo TLR3 e a consequente indução do estado anti-viral. De forma a evitar este efeito, sobreviver e replicar-se com sucesso, existem inúmeras estratégias virais para evasão da resposta imune e/ou manipulação da produção ou efeito do interferão. o facto de que o VPSA está adaptado à sobrevivência em hospedeiros vertebrados e invertebrados (que partilham apenas alguns mecanismos conservados da imunidade inata) levou-nos à procura de um antagonista dos receptores de tipo ToU no genoma do VPSA. o facto de que o VPSA está adaptado à sobrevivência em hospedeiros vertebrados e invertebrados (que partilham apenas alguns mecanismos conservados da imunidade inata) levou-nos à procura de um antagonista dos receptores de tipo Toll no genoma do VPSA. A proteína 1329L do VPSA foi descrita como uma proteína transmembranar de tipo I, com duas repetições ricas em leucina no domínio extracelular e uma homologia detectável com o domínio TIR (domínio homólogo ao receptor Toll/interleucina-l) do TLR3. Estas características implicam a possibilidade de que a proteína viral I329L seja capaz de inibir a indução de IFN-β através de uma interacção inibitória com o motivo TIR dos receptores de tipo Toll, assim como das suas proteínas adaptadores correspondentes (com a função de propagar os sinais enviados pelos receptores de tipo Toll). O domínio TIR 00 TLR3 interage com a proteína adaptadora TRIF ("Adaptador indutivo do interferão-(3 com um domínio TIR"), que transmite o sinal ao longo da via; em teoria, uma vez que o domínio TIR da I329L é homólogo ao domínio TIR do TLR3, a I329L poderá interagir com o TRIF, uma hipótese que foi estudada ao longo deste trabalho. Esta homologia estrutural foi correlacionada com ensaios prévios de actividade de luciferase expressa em genes repórter, que demonstram claramente uma inibição da indução de IFN-β e activação de NF-kB mediada pelo TLR3. Assim, este trabalho tem como objectivo obter uma melhor compreensão dos mecanismos pelos quais a proteína I329L inibe a activação das vias de sinalização do TLR3. Graças à informação fornecida pelas homologias previamente mencionadas, este objectivo tem, por sua vez, duas vertentes: 1) Explorar a possível formação de heterodímeros sem capacidade de sinalização con-stituídos por I329L e TLR3, e as consequências desta interacção; e 2) Determinar o mecanismo de inibição da sinalização do TLR3 pelo domínio intracelular da proteína I329L com regiões TIR, de forma a confirmar a interacção do mesmo com o seu alvo teórico, TRIF. Para este efeito, segmentos do gene I329L correspondentes ao domínio extracelular transmembranar e ao domínio intracelular foram clonados em plasmídeos de expressão em mamíferos de forma a averiguar o impacto dos domínios constituintes da proteína na sinalização da via do TLR3. Inicialmente, foi determinado que o domínio extracelular da I329L interage apenas com o TLR3, inibindo a activação da via apenas quando esta é estimulada por um análogo sintético do RNA de cadeia dupla, o ácido poli-inosínico /policitidílico (Poly (I:C)), mas não quando esta é estimulada pela expressão ectópica de TRIF; por outro lado, o domínio intracelular da I329L interage a jusante do TLR3, visto inibir a via do TLR3 quando sujeito a ambos os tipos de activação. Esta interacção por parte do domínio intracelular foi posteriormente caracterizada como sendo uma interacção directa com a proteína adaptadora TRIF através de ensaios de imunoprecipitação. Assim, uma reconstrução bioinformática da estrutura da I329L foi feita através de métodos de modelação proteica com base em homologias evolutivas, com o objectivo de delinear estratégias adequadas para a caracterização funcional da I329L. A análise do domínio intracelular permitiu determinar a localização das três regiões descritas na literatura como sendo homólogas do domínio TIR do TLR3; esta informação levou-nos a proceder com mutagénese dirigida da região central de forma a desregular a possível interface de interacção com TRIF. O resultado deste ensaio revelou-se infrutífero, permitindo-nos inferir que a região central de homologia pode não ser estritamente necessária para a interacção com TRIF, ou que as duas outras regiões podem ter um efeito de compensação da actividade inibitória após desregulação da região central. Para averiguar estas hipóteses, serão feitos outros ensaios de mutagénese no futuro. A análise estrutural do domínio extracelular permitiu-nos determinar a existência na I329L de domínios semelhantes ao domínio de ligação ao RNA de cadeia dupla e domínio de dimerização do TLR3. De forma a averiguar a hipótese de uma interação directa com o TLR3, um segmento do domínio extracelular sem o domínio de ligação ao RNA foi clonado no plasmídeo de expressão adequado; este segmento manteve a sua actividade inibitória do TLR3, indicando que a interacção da I329L com o TLR3 é independente da ligação ao RNA. Foram desenvolvidos dois ensaios para detecção de uma interacção directa da I329L com o TLR3: um ensaio de separação electroforética sem desnaturação proteica (BN-PAGE) , cujos resultados foram por si só inconclusivos mas defendiam a possibilidade desta interacção; e um ensaio de ligação cruzada de proteínas in vivo, cujos resultados demonstraram formação de heterodímeros I329L-TLR3, assim como de homodímeros I329L-I329L. Uma vez que este tipo de ensaios não permite afirmar sem qualquer dúvida a existência de uma interacção específica, averiguámos também o impacto da I329L e do domínio extracelular ao nível da via de sinalização do TLR3 independente de TRIF; uma vez que esta via é activada pelo domínio extracelular e inibida pela proteína completa, concluímos que existe dimerização com o TLR3, sendo que o efeito diferencial se deve à disponibilidade do local de interacção com a proteína c-Src no domínio intracelular do TLR3. Finalmente, com base nos resultados descritos previamente, decidimos averiguar a possibilidade de a I329L ter um efeito inibitório em outros TLR que não o TLR3. Descrevemos a existência de actividade inibitória da I329L nas vias do TLR4, TLR5, TLR7 e TLR9, que reconhecem outros tipos de moléculas; este resultado cimenta a hipótese da existência de uma interacção directa da I329L com TLRs através do seu domínio de dimerização, sem necessidade de domínios de interacção com ligandos. Em resumo, concluímos que a proteína I329L do vírus da Peste suína africana é uma proteína inibitória da via de sinalização dos TLR com duas actividades distintas: 1) inibição geral das vias de sinalização dos vários TLR através de interferência com o processo de dimerização, possivelmente pela formação de heterodímeros sem capacidade de sinalização; 2) inibição das vias de sinalização do TLR3 e TLR4 através de interacção directa com a proteína adaptadora TRIF, inibindo a transmissão do sinal a jusante dos mesmos.
