Author(s): Lima, Nádia Sofia de Carvalho
Date: 2015
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/20164
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Cultura celular 3D; Teste de viabilidade em esferoides; Cancro do pulmão; NSCLC; Inibição da via KRAS; Drug screening; Teses de mestrado - 2015; Departamento de Química e Bioquímica
Tese de mestrado em Bioquímica Médica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015
O cancro do pulmão é uma das principais causas de morte no mundo. Só em 2012 na Europa cerca de 388.000 mortes foram registadas. Apesar da existência de algumas drogas eficazes para o tratamento do cancro do pulmão, o reaparecimento da doença é frequente após o tratamento. A aquisição de mutações pontuais que causam resistência e aparecimento de vias de sinalização alternativas e compensatórias é a principal causa. Apesar da conhecida associação do cancro do pulmão com o tabagismo, outros fatores de risco são conhecidos. Entre os principais, conta-se a história familiar. Alterações genéticas incluem na maioria dos casos mutações nos genes p53, Bcl2, Rb, FHIT e p16INK. Perda de heterozigotia, mudanças em telomerases e a ativação constitutiva do oncogene KRAS são também evidentes fatores de risco. Dentro do vasto painel de mutações para KRAS, pode contar-se como mais comum a G12D, responsável pelo desenvolvimento do subtipo cancro do pulmão de células não-pequenas (NSCLC), um dos mais agressivos. A proteína RAS é codificada pelo gene KRAS. Pertence à família das GTPases e tem como função molecular a ativação e desativação por fosforilação de GDP a GTP e vice-versa. Está envolvida numa longa cascata de transdução do sinal responsável pela proliferação e sobrevivência celular. As mutações em KRAS têm portanto um papel fundamental no aparecimento e desenvolvimento do cancro. A sua ativação constitutiva leva à continua estimulação das vias de sinalização a jusante promovendo a constante proliferação e sobrevivência, reprogramação metabólica, reorganização do citoesqueleto, inflamação e remodelação do microambiente para adaptação tumoral. Até à data, a direta inibição do mutante KRASG12D tem-se revelado impossível. Contudo, a proteína RAS encontra-se no topo de uma bifurcação de sinalização, tendo como principais alvos cinases como RAF, MEK, AKT e PI3K. Deste modo, alguns inibidores têm sido desenvolvidos nos últimos anos com o objetivo de bloquear alguns destes efetores tanto a montante como a jusante das vias de sinalização RAS. Inibidores das proteínas MEK e PI3K são dois casos já clinicamente aprovados. Contudo, os progressos têm sido frequentemente atenuados devido à enorme capacidade da proteína RAS em alcançar inúmeras vias de sinalização alternativas e compensatórias, apontando para a necessidade do uso de terapias combinadas. O laboratório de Julian Downward, tem reunido esforços valiosos para a identificação de dependências exclusivas do mutante KRAS. A título de exemplo foi demonstrado que os inibidores MEK são seletivamente tóxicos para o mutante KRAS, enquanto o mesmo já não acontece para os inibidores de PI3K. Complementarmente, foram identificadas algumas dependências seletivas do mutante KRAS para atividades que não são diretamente reguladas pelo oncogene RAS. O mutante KRAS é por exemplo dependente da cinase de ligação 1 (TBK1), da cinase-1 ativada pelo fator de crescimento transformador β (TAK1), do fator de transcrição GATA2, da ciclina dependente de cinases CDK4, de alguns reguladores mitoticos, componentes do proteassoma entre outros. A grande maioria do conhecimento científico adquirido nesta área foi desenvolvido em culturas celulares em mono-camada com linhas celulares originárias de tumores de pacientes. Contudo, a sua manutenção prolongada em cultura conduz a um inevitável estado de adaptação e dependência gerados pela adição continua de suplementos ao meio de cultura. Este ambiente artificial leva à acumulação de mutações, e quando comparadas com células in situ, diferenças a nível molecular como diferentes expressões de marcadores de diferenciação, adesão e recetores de fatores de crescimento, podem ser encontradas. A credibilidade destes métodos em representar o tumor original e a confiança com que podem fornecer informações acerca de previsões clinicas começa então a ser posta em causa. O desenvolvimento de novos fármacos requer modelos que possam simular exatamente as condições in vivo e que possam ter relevância clínica. Desta forma, os modelos de cultura tridimensionais (3D) têm ganhado ênfase dentro da comunidade científica devido à sua capacidade em reproduzir a situação in vivo. Estas são conhecidas por manter o fenótipo de células tumorais funcional e copiar características morfológicas, fisiológicas, patológicas e ambientais do tumor. A organização de uma estrutura multicelular e o microambiente envolventes têm um impacto notório na sobrevivência e progressão tumoral. Estes têm também um papel fundamental na expressão genética, fenótipo e resposta/sensibilidade a diferentes inibidores terapêuticos. As culturas 3D são capazes de abranger todas estas características, eliminando algumas das desvantagens presentes nas culturas bidimensionais (2D). São portanto uma ferramenta bastante promissora no que diz respeito ao desenvolvimento rápido de novas terapias, diminuindo custos de estudos preliminares e indo de encontro ao progresso farmacêutico e clínico. Neste projeto, dado as descritas vantagens dos modelos 3D, foi desenvolvido um método 3D que permita o crescimento e sobrevivência celular de NSCLC conjuntamente com um método que permita a monitorização da viabilidade celular em esferoides. Seguidamente, tendo em conta as vulnerabilidades da mutação KRAS e as suas dependências já mencionadas anteriormente, foram realizados testes de comparação 2D e 3D com o intuito de averiguar quão dependente a via de sinalização RAS é do método de cultura implementado. Pretendeu-se estudar que tipo de diferenças morfológicas, de sinalização e sensibilidade a inibidores existiam que pudessem conferir maior sensibilidade a culturas 2D ou 3D. Vários métodos de cultura celular 3D já são conhecidos. Suspensões celulares podem ser usadas principalmente para formar simples aglomerados celulares. Superfícies antiaderentes são uma opção, assim como a técnica da hanging-drop, onde suspensões celulares são cultivadas em pequenas gotas invertidas num meio especificamente viscoso e controlado. Forças gravitacionais induzem a formação de esferas de colónias celulares. Alternativamente, culturas envoltas em componentes da matriz extracelular, como matrigel, metilcelulose, fibronectina, laminina e colagénio formam esferoides com características específicas do tumor original. Este tipo de método permite a interação célula-célula e célula-matriz, permitindo inclusive o crescimento e sobrevivência de células dependentes de ancoragem. Resultados demonstraram que culturas em matrizes com componentes da matriz extracelular, no caso testado em 2.5% (v/v) de matrigel, são fundamentais para a sobrevivência celular de NSCLC, determinando em certos casos uma definida organização estrutural e diferenciação celular. Métodos para o controlo da viabilidade celular também se encontram disponíveis no mercado, contudo a exata determinação da viabilidade em esferas está limitado à capacidade de penetração dos reagentes indicadores nas mesmas. Propriedades de lise são fundamentais para uma maior sensibilidade, atribuindo as maiores vantagens ao ensaio CellTiter-Glo cujo sinal de fluorescência é proporcional à quantidade de ATP as células. Resultados demonstram ainda que os níveis de actividade de p-ERK estão especialmente elevados quando as células são cultivadas em 3D, mas que as demais proteínas envolvidas nas vias de transdução do sinal RAS como p-AKT e p-MLC, não se encontram particularmente alteradas entre os dois métodos de cultura celular. Diferenças entre 2D e 3D relativamente a dependências do mutante KRAS, foram também estudadas. Primeiramente, um teste com uma biblioteca de 384 inibidores de cinases foi corrido automaticamente em esferas e comparado diretamente com um ensaio independente em 2D para uma linha celular diferente mas com a mesma mutação KRAS. A análise dos dados salientou 10 inibidores como tendo um efeito citotóxico nos esferoides e um efeito oposto de crescimento celular nas culturas 2D. A partir deste ponto novos testes em escala mais pequena foram realizados e novos inibidores, conhecidos por conferir vulnerabilidade às células com a mutação KRAS foram usados. A respetiva viabilidade celular foi monitorizada em 2D e 3D para concentrações crescentes de inibidor. Dentro da lista de inibidores candidatos usados podem contar-se inibidores das proteínas MEK, PI3K, IKK, PKC, CDK, mTOR, TGF-β, LDH-A, c-Met, Rho e FAK, assim como inibidores do proteassoma e destabilizadores estruturais como a Latrunculina e Paclitaxel. Resultados sugerem que em comparação com culturas 2D, as 3D são especialmente sensíveis a drogas que interferem com a organização da estrutura celular, como é o caso de estabilizadores da tubulina e inibidores da actina. Culturas 3D demonstram também maior sensibilidade perante inibidores da proteína cinase C (PKC) enquanto que culturas 2D são mais vulneráveis a inibidores MEK. Contudo, os resultados indicam ainda que a dependência KRAS é especifica de cada linhagem celular, uma vez que variabilidades entre 2D e 3D podem ser encontradas de caso para caso. Tentativas preliminares de recriar um modelo knockdown especificamente para o mutante KRAS, com RNA de interferência (siRNA), tiveram pouco sucesso. No entanto o desenho deste modelo geneticamente modificado terá significância para futuros testes com culturas 3D. O knockdown dum oncogene importante como KRAS torna as células bastante sensíveis. Um modelo estável funcionará como controlo em novos ensaios e determinará a especificidade e atribuição dos resultados à mutação KRAS. Os resultados alcançados não desvalorizam a importância do uso de plataformas 3D como forma de obter melhores previsões terapêuticas. Pode eventualmente ser a ferramenta indicada para encontrar novos alvos terapêuticos melhorando as perspetivas de tratamento. É porém um trabalho ainda em progresso que espera novos testes automáticos com largas gamas de inibidores de forma a expor potenciais drogas com exclusiva vulnerabilidade KRAS em culturas 3D.
Lung cancer is a leading cause of death worldwide. Genetic features like KRAS mutations are known to be a risk factor. The GTPase switcher RAS takes part on many aspects of the cell pathway and signal transduction. Example of that is its recognized involvement in cell survival, proliferation, metabolism, motility, immune response and many others. RAS constitutive activation driven by the common G12D KRAS mutation is responsible for numerous cancer hallmarks. To date, direct target of the mutant KRAS is still poorly efficient. Despite all the efforts and continuous advances in targeting either upstream and downstream KRAS effectors, there is still a long path to be taken with dubious questions to be answered. Several inhibitors are already in clinic, however the ability of RAS to compensate targeted pathways, and activate other effector kinases reduces their efficiency in the clinical setting. Other difficulty in the drug development field is to extrapolate the in vitro results to in vivo predictions. In this regard, 3D cultures are known to better model the in vivo situation than the frequently used 2D cultures. In vivo morphologic, physiologic, pathologic and functional environmental features of the tumor biology are aspects that can be simulated by 3D models, better predicting and evaluating therapeutic outcomes. In this work, 3D culture models of NSCLC (non-small cell lung cancer) cell lines have been developed along with an appropriate method to monitor cell viability in spheroids. The presence of an artificial extracellular matrix is shown to support proliferation and survival of NSCLC, promoting a non-anchorage independent multicellular growth. 3D models are also shown here to encourage cell structural organization and differentiation. Besides, the activity of p-ERK is especially elevated in these systems. A metabolic ATP-based viability test integrated with an efficient cell lysis is described as being an efficient, sensitive and accurate tool to evaluate the viability of spheroids. It is also shown that 2D and 3D culture cells have different sensitivities to drug treatments. Whereas 3D cultures are mostly vulnerable to structural stability disruption and PKC inhibition, 2D cultures show increased sensitivity upon MEK inhibition. Nevertheless, vulnerabilities and KRAS dependency is cell line dependent and variability can be found between 2D and 3D models. However, results do not diminish the importance of using 3D cultures as valuable platforms to get better in vivo therapeutic predictions. It can eventually be the tool we are lacking to find new target therapies. It is therefore still a work in progress awaiting for a large-scale drug screen in order to highlight potential 3D exclusive drug candidates.
