DNA barcoding and forensic entomology: a molecular approach for Diptera species' identification

• Author(s): Rolo, Eva Sofia Alves, 1986-
• Date: 2010
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/2024
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Entomologia; Ciência forense; Biologia molecular; Teses de mestrado
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-; Rebelo, Maria Teresa Ferreira Ramos Nabais de Oliveira, 1964-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado em Biologia (Biologia Humana e Ambiente),Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010

A Entomologia Forense é a ciência que aplica o conhecimento sobre os insectos, e outros artrópodes, em procedimentos jurídico-legais. O primeiro passo a ser tomado em Entomologia Forense é a identificação das espécies, normalmente realizada através de caracteres morfométricos, utilizando chaves dicotómicas de identificação; no entanto, a observação da morfologia é um método, por vezes, demorado e inconclusivo. Por outro lado, os métodos moleculares fornecem uma identificação rápida e precisa, possibilitam a identificação dos insectos em qualquer estádio de desenvolvimento, incluindo os estádios larvares, e podem ser utilizados independentemente das condições de preservação dos exemplares. Na verdade, as metodologias para identificação molecular de espécies têm sofrido uma grande evolução e, actualmente, o DNA barcoding é considerado uma ferramenta muito útil na identificação de espécies. Este conceito baseia-se na amplificação e sequenciação de um pequeno segmento de DNA - conhecido como sequência barcode - de uma região padrão do genoma. Vários estudos sugerem o uso da sequência que codifica para a subunidade I da proteína citocromo c oxidase (COI) como o marcador de DNA adequado para o DNA barcoding. A identificação de espécies através desta nova ferramenta baseia-se na amplificação e sequenciação deste fragmento; uma vez obtida a informação da sequência do espécime-alvo é possível compará-la com sequências de referência, isto é, sequências de espécies previamente identificadas, já existentes numa biblioteca digital. A identificação de espécies através do DNA barcoding implica, numa analise filogenética, que cada espécie surja como um grupo monofilético. Apesar, deste novo conceito se basear no uso de métodos de construção de árvores filogenéticas, não deve ser interpretado como tal, uma vez que a sequência barcode não apresenta, frequentemente, um sinal filogenético suficiente para determinar relações evolutivas. Um outro critério para a delineação de espéciesassenta em valores limite para as divergências nucleotídicas intra e interespecíficas. Um dos limites é de 3% (valor estabelecido para insectos), em que valores de divergência intra-específica abaixo deste limite determinam uma única espécie e valores de divergência interespecíficas acima, apontam para diferentes espécies. O outro limite, que surge como uma actualização do primeiro, sugere que a média da divergência nucleotídica entre espécies pertencentes ao mesmo género deve ser 10 vezes superior à média da divergência intra-específica encontrada para as mesmas espécies. A observação destes três critérios permite, assim, determinar se estamos perante a mesma espécie ou espécies diferentes O Barcode of Life Data System (BOLD) é um software responsável pela gestão de dados obtidos através da ferramenta DNA barcoding. O sistema de identificação do BOLD é a unidade funcional para a identificação de espécimes no qual, a sequência obtida é submetida e comparada com as sequências referência, à semelhança dos sistemas utilizados noutros bancos de dados para a identificação de espécies (por exemplo, a base de dados GenBank do National Center for Biotechnology Information, NCBI). A existência de evidências entomológicas pode ser de grande importância para casos forenses. De facto, estas podem fornecer informações importantes que poderão orientar o decorrer da investigação criminal. A criação e implementação de uma Base de Dados de espécies de insectos é um passo importante para a Entomologia Forense. Com efeito, qualquer país que possua um serviço de Entomologia Forense eficaz e cientificamente bem suportado deve ter um conhecimento abrangente da diversidade de insectos. O uso do DNA barcoding sugere a sua utilidade na identificação de espécies de insectos encontrados em cenários forense. Apesar das vantagens científicas e pragmáticas existentes no conhecimento da diversidade de insectos em qualquer região do globo, a utilização deste marcador genético em bancos de dados exige que seja determinada a sua eficácia na distinção entre espécies. Este estudo foi desenvolvido e escrito com vista à preparação de dois artigos científicos que serão submetidos a revistas internacionais damarcador COI. Como anteriormente, todas as amostras foram facilmente amplificadas e sequenciadas. Os resultados mostraram que foi possível identificar 67.6% dos indivíduos, ao nível da espécie através da base de dados GenBank. Através da base de dados BOLD foi possível identificar 58.8% dos espécimes, também ao nível da espécie. No total foram identificados 49 espécimes pertencentes a 11 espécies diferentes: Eudasyphora cyanella (Meigen, 1826), Lucilia caesar (Linnaeus, 1758), Pollenia rudis (Fabricius, 1794), Musca autumnalis (De Geer, 1776), Phaonia subventa (Harris, 1780), Phaonia tuguriorum (Scopoli, 1763), Helina impucta (Fallén, 1825), Helina evecta (Harris, 1780), Helina reversio (Harris, 1780), Hydrotaea dentipes (Fabricius, 1805) e Hydrotaea armipes (Fallén, 1825). As sequências correspondentes a estas amostras foram utilizadas, posteriormente, para a análise filogenética e para o cálculo das divergências nucleotídicas intra e interespecíficas. Na análise filogenética foi possível observar situações de monofilia para todas as espécies. No que diz respeito à avaliação das divergências nucleotídicas entre espécies do mesmo género, os valores limite possibilitaram a discriminação de cada espécie. Em suma, estes resultados corroboraram a eficácia do gene COI para identificação de espécies.Por fim, o Capítulo 4 destina-se às Considerações Finais, onde é referida a importância deste trabalho para a aplicação do marcador COI em bases de dados, utilizadas não só em situações de contexto forense mas também para o conhecimento global da diversidade biológica bem como a sua importância para a contribuição de uma base de dados da biodiversidade nacional. Forensic entomology is the science, which applies knowledge of insects (and other arthropods) to civil proceedings and criminal trials. Indeed, the existence of entomological evidences can be of great importance to forensic cases, because they can provide relevant information to delineate the course of the investigation; however, the species-level identification of specimens found on corpse is extremely important. Use of cytochrome c oxidase I (COI) as molecular marker for DNA barcoding project suggests that this approach could be very useful in forensic scene, where fast and accurate tools for species identification are essential. Molecular database implementation for insects’ species is a very important step for the evolution of forensic entomology. Indeed, any country that wishes to have an effective and scientifically well supported forensic entomology service must have a comprehensive knowledge of insects’diversity.The main goals of this study are to provide evidence of the COI performance to be used as an effective, reliable and fast tool for an identification database and to determine what extent Barcode of Life Data System (BOLD) and GenBank databases are able, at that time, to identify insects’ species with relevance. The COI fragment proposed for DNA barcode was sequenced and nucleotide sequence divergence within and between species and phylogenetic analysis were performed. In the two studies, COI allows observation of species discrimination as strongly supported monophyletic groups and intra and interspecific nucleotide divergences confirm the potential of COI in species delimitation. The results also showed that GenBank allowed to identify more sequences than BOLD, although the two databases have shown a good ability to identify insects’species.

Forensic entomology is the science, which applies knowledge of insects (and other arthropods) to civil proceedings and criminal trials. Indeed, the existence of entomological evidences can be of great importance to forensic cases, because they can provide relevant information to delineate the course of the investigation; however, the species-level identification of specimens found on corpse is extremely important. Use of cytochrome c oxidase I (COI) as molecular marker for DNA barcoding project suggests that this approach could be very useful in forensic scene, where fast and accurate tools for species identification are essential. Molecular database implementation for insects’ species is a very important step for the evolution of forensic entomology. Indeed, any country that wishes to have an effective and scientifically well supported forensic entomology service must have a comprehensive knowledge of insects’ diversity.The main goals of this study are to provide evidence of the COI performance to be used as an effective, reliable and fast tool for an identification database and to determine what extent Barcode of Life Data System (BOLD) and GenBank databases are able, at that time, to identify insects’ species with relevance. The COI fragment proposed for DNA barcode was sequenced and nucleotide sequence divergence within and between species and phylogenetic analysis were performed. In the two studies, COI allows observation of species discrimination as strongly supported monophyletic groups and intra and interspecific nucleotide divergences confirm the potential of COI in species delimitation. The results also showed that GenBank allowed to identify more sequences than BOLD, although the two databases have shown a good ability to identify insects’ species.

PTDC/SAU-ESA/101228/2008 project – Forensic Entomology: Morphometric and Molecular databank (mtDNA) to identify species (Diptera and Coleoptera) with forensic interest – funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT).