Author(s): Nunes, Catarina Sofia Duarte
Date: 2015
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/20850
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Dilp8; D. melanogaster; H. illucens; Tempo de desenvolvimento; Msturação peptídica; Teses de mestrado - 2015; Departamento de Biologia Animal
Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
Em Drosophila melanogaster, após a eclosão do ovo, a larva desenvolve-se ao longo de três estádios larvares, que são seguidos pela formação da pupa, terminando assim a fase de crescimento. O tempo das várias transições do desenvolvimento do insecto é influenciado por factores ambientais e é regulado pela hormona esteroide, ecdisona. Os padrões de crescimento e morfogénese a que o animal é sujeito durante o período de desenvolvimento são determinados e, portanto, previsíveis. No entanto, para que seja produzido um organismo com dimensões corporais apropriadas e em sintonia com o ambiente, estes processos podem ser afectados por condições extrínsecas (como a nutrição) ou por perturbações intrínsecas que ocorram, por exemplo, durante a regeneração de um órgão e/ou tecido. Esta capacidade que um organismo tem de lidar com estas perturbações, refletindo proporções corporais corretas é designada por estabilidade de desenvolvimento. Esta é uma propriedade muito relevante para o desenvolvimento, pois a alteração das dimensões corporais e/ou de órgãos de um animal pode afectar a sua fitness e, consequentemente, o seu output reprodutivo. Na larva da grande maioria dos insectos holometabólicos (insectos que sofrem uma metamorfose completa entre os estádios de ovo, larva, pupa e adulto), os discos imaginais representam os percursores da maioria dos apêndices do indivíduo adulto, tais como as asas ou as patas. Os discos imaginais têm a capacidade de se regenerarem durante a fase de crescimento larvar, mesmo após dano químico (por agente alquilante, por exemplo) ou físico (por irradiação raio-x). No entanto, quando estas estruturas são danificadas, a transição de larva para pupa é atrasada o tempo suficiente para que as células ajustem as suas taxas de proliferação, permitindo a reparação dos danos. Sendo que os discos imaginais estão remotamente localizados em relação ao cérebro, onde são produzidas as hormonas responsáveis pelo controlo do tempo de desenvolvimento, o mecanismo através do qual as deficiências de crescimento influenciam o tempo de metamorfose tem que ser dependente de um ou mais sinais difusíveis. Ao sentirem que não atingiram o tamanho apropriado, os discos comunicam o seu estado anormal ao resto do corpo, através da secreção de um sinal que impede a pupariação até que seja atingida a dimensão ideal. Recentemente, dois grupos de investigação independentes descobriram o principal elemento envolvido neste mecanismo de regulação: Dilp8. Dilp8 é um péptido pertencente à superfamília das insulinas/IGFs/relaxinas, que é secretado pelos discos imaginais em situações de crescimento anormal. Todos os péptidos pertencentes a esta família apresentam uma estrutura semelhante àquela das preproinsulinas, consistindo na associação contígua entre um péptido sinal, uma cadeia B, um péptido- C e uma cadeia A. Nas insulinas e relaxinas (mas não nos IGFs), o péptido-C é clivado pela ação de uma convertase, que reconhece sequências de clivagem específicas, dando origem a um péptido maturo ativo. Apesar da importância de Dilp8 na regulação da estabilidade do desenvolvimento já ter sido demonstrada, até à data continua por determinar qual o mecanismo de ação molecular que permite a coordenação do crescimento anormal e do tempo desenvolvimento. Este projeto pretendia então explorar os mecanismos moleculares de ação e a evolução de Dilp8. Para tal, foram utilizadas moscas transgénicas e o sistema de sobrexpressão UAS-Gal4. Inicialmente, foi desenvolvido um estudo de evolução molecular que revelou a existência de homólogos de Dilp8 em várias espécies de dípteros, pertencentes ao ramo Brachycera. O alinhamento das sequências proteicas destes homólogos permitiu a identificação de resíduos de aminoácidos absolutamente conservados entre as diferentes espécies. Para tentar perceber quais destes resíduos estavam intimamente associados à função desempenhada por Dilp8 no controlo do tempo de desenvolvimento, foram criadas linhas de moscas que continham uma versão alterada de Dilp8. Nestas linhas, cada um destes aminoácidos foi, individualmente, substituído por outro ou completamente eliminado. O tempo do início da metamorfose foi analisado nestas linhas de moscas sobrexpressando de forma ubíqua cada um dos péptidos alterados e verificou-se que, de facto, a alteração de alguns destes aminoácidos levou à eliminação do atraso no desenvolvimento, provocado pela sobrexpressão da versão wild-type de Dilp8. Os dados obtidos parecem indicar que Dilp8 precisa de ser processado para que o péptido maturo promova a estabilidade do desenvolvimento. No entanto, embora a produção da versão não processada do péptido tenha sido confirmada em todas as linhas transgénicas em estudo, em nenhum dos casos foi possível a detecção do péptido maturo por Western Blot.. Tal dificultou a confirmação da hipótese sugerida pelos resultados obtidos. Para obter mais conhecimento acerca do papel do péptido-C na regulação do tempo de desenvolvimento, este foi sobrexpresso sozinho (sem qualquer outro elemento de Dilp8) e verificou-se que este não apresentou a capacidade de atrasar a metamorfose. Em D. melanogaster, a sobrexpressão de Dilp8 tem outro efeito para além do atraso no tempo de desenvolvimento: as moscas tornam-se mais pesadas sem, no entanto, aumentarem as suas dimensões corporais. De modo a explorar o envolvimento do péptido-C neste fenótipo, as pupas de diferentes genótipos de sobrexpressão de péptidos alterados foram pesadas. Não foram obtidas diferenças de peso diretamente relacionadas com a alteração do péptido-C, indicando que esta região de Dilp8, embora possa estar envolvida noutra funções biológicas, não é diretamente responsável pelo aumento de peso verificado. O estudo das sequências homólogas de Dilp8 permitiu ainda explorar a história evolutiva deste péptido. Para tal, foi utilizada uma espécie mais ancestral, Hermetia illucens, para a qual um RNAseq revelou a existência de, pelo menos, duas sequências homólogas de Dilp8. Para verificar se esta versão ancestral do péptido (Hilp8) mantém a capacidade de induzir atrasos no desenvolvimento quando sobrexpresso em D. melanogaster, um dos homólogos de Dilp8 foi clonado nesta espécie. Os resultados desta abordagem revelaram que Hilp8 não tem a capacidade de regular o tempo de desenvolvimento de Drosophila. Porém, tal como discutido ao longo do trabalho, tal não indica diretamente que a forma ancestral de Dilp8 apresentava uma função diferente em H. Illucens. Este trabalho permitiu ainda confirmar a existência de, pelo menos, duas regiões do genoma diferentes responsáveis pela codificação de duas sequências homólogas de Dilp8. A análise estrutural destas duas sequências permitiu, ainda, a distinção de, pelo menos, três exões para ambas, tal como é característico da maioria dos Ilps. De modo a entender se Hilp8 apresenta outro tipo de homologia funcional em relação a Dilp8, uma nova análise de RNAseq foi desenvolvida, com a utilização de larvas de H. Illucens sujeitas à injeção do agente alquilante EMS. Em Drosophila, a exposição a esta droga leva à ativação da via de Dilp8 e, consequentemente, a atrasos na pupariação. Em H. Illucens não foi possível a determinação de um aumento da transcrição de hilp8, após a exposição a EMS. Porém, foi detectada uma elevada variação de expressão entre amostras biológicas. Esta observação dificulta a determinação do envolvimento de Hilp8 na resposta ao dano. Para estudar a homologia funcional de Dilp8 e das duas formas de Hilp8, a expressão dos genes no tecido reprodutivo de fêmeas foi analisada H. Illucens adultas e, contrariamente ao que é verificado em Drosophila, estes não se encontram enriquecidos em ovários. Este resultado pode indicar um funcionamento divergente dos dois homólogos. Em suma, este estudo, com a utilização de abordagens fisiológicas, moleculares e de evo-devo permitiu aumentar o nosso conhecimento acerca do funcionamento e da história evolutiva de Dilp8.
In insects, development follows predictable growth and morphogenesis patterns that involve both tight control and flexibility in the regulation of cell size and number, in order to produce an animal with proper body and organ size. However, as environmental and intrinsic perturbations can affect these processes, organisms have evolved the capability to buffer these perturbations through developmental stability processes. Abnormally growing imaginal discs of Drosophila delay pupariation by secreting Dilp8, an insulin/IGF/relaxin-like peptide. Dilp8 promotes developmental stability by coordinating the growth of the discs with the onset of metamorphosis. Although the importance of Dilp8 in the regulation of metamorphosis has already been demonstrated, its structure, sequence conservation and posttranslational processing have never been studied. My objective was to learn more about the molecular mechanisms of action and evolution of Dilp8. By using physiological and molecular genetics approaches, it was possible to determine conserved amino acids crucial for Dilp8 function and to propose a requirement for Dilp8 C-peptide processing for the coordination of tissue damage and developmental timing. These studies also shed light into the evolutionary history of Dilp8. An Evo-Devo approach was used to study the expression and function of Dilp8 homologues from a brachyceran fly that shared a common ancestor with Drosophila about 180 million years ago, Hermetia illucens. RNA-Seq analyses suggest H. illucens encodes at least two Dilp8 homologues Hilp8a and Hilp8b, none of which responds to ethylmethanesulfonate-induced tissue damage. Furthermore, ubiquitous expression of Hilp8a in Drosophila larvae did not delay development when expressed in Drosophila. These results suggest that the involvement of Dilp8 in the developmental stability pathway in Drosophila might have evolved after the last common ancestor of all Brachycera lived. However, more studies need to be developed for this to be confirmed.
