Author(s): Pires, Vanessa Borges
Date: 2015
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/22529
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Distrofia muscular de Duchenne; Terapias de modulação de Splicing; Oligonucleótidos modificados com LNAs; Skipping de exões; Splicing; Teses de mestrado - 2015; Departamento de Biologia Vegetal
Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
A base hereditária de cada organismo vivo é o genoma, uma longa sequência de ácido desoxirribonucleico (DNA), que contém a informação genética organizada em genes. Em eucariotas, os genes são compostos por exões, interrompidos por intrões. Os exões contêm a informação genética que é traduzida em proteína. Uma vez que a informação genética se encontra no núcleo da célula, e a maquinaria de tradução está localizada no citoplasma, é necessária a formação de um ácido ribonucleico (RNA) mensageiro temporário (pré-mRNA). Este pré-mRNA é processado no núcleo, por uma série de passos que incluem o capping da extremidade 5’, a remoção de intrões e junção de exões, o splicing e a clivagem e poliadenilação da extremidade 3’. O RNA mensageiro resultante (mRNA) é exportado para o citoplasma, tornando-se disponível para os ribossomas, onde a tradução em proteína decorre. O splicing é um processo altamente complexo e regulado no qual estão envolvidas centenas de proteínas. O splicing alternativo, que ocorre quando um único gene origina mais do que uma sequência de mRNA, é um mecanismo importante para a regulação da expressão génica. Uma vez que o splicing e o splicing alternativo são mecanismos extremamente importantes e conservados na Natureza, a sua disrupção pode levar a doenças. Apesar de a disrupção destes mecanismos estar subjacente a muitas doenças hereditárias e adquiridas, a modulação do splicing através da utilização de oligonucleotídeos antisense pode ter aplicações terapêuticas. A modulação de splicing pode ser conseguida in vitro com o uso de compostos químicos ou oligonucleotídeos antisense (AONs) que se podem ligar a uma determinada sequência do pré-mRNA e regular o splicing do gene, quer para restaurar a função do gene ou para inibir a expressão génica. A modulação do splicing oferece esperança para o combate de muitas doenças genéticas, que são atualmente incuráveis. O exemplo mais notável desta aplicação terapêutica é na Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), causada principalmente por mutações nonsense e de frame-shift no gene DMD, localizado no cromossoma X, que codifica para a proteína distrofina. As distrofias musculares constituem um grupo heterogéneo de doenças genéticas musculares caracterizadas por um progressivo enfraquecimento, atrofia e degeneração muscular. As distrofias musculares associadas a deficiências no gene da proteína distrofina, podem apresentar vários fenótipos, desde o mais grave e mais comum – a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), até ao mais ligeiro – a Distrofia Muscular de Becker (BMD). A DMD mais severa, apresenta uma incidência de 1 em cada 3500 recém-nascidos do sexo masculino, apresentando a BMD, a mais ligeira, uma incidência de 1 em cada 18 500. A distrofina é a proteína responsável pela manutenção da estabilidade da membrana das fibras musculares. Mutações neste gene levam à perda de função da proteína, sendo esta patologia caracterizada pela ausência de distrofina funcional no músculo cardíaco, esquelético e liso. Apesar dos esforços, nenhuma terapia eficaz e clinicamente aplicável foi ainda desenvolvida, sendo no entanto possível atrasar o onset da doença recorrendo a terapias com glucocorticoides. Têm sido investigadas terapias genéticas de correção da reading frame, sendo as abordagens mais promissoras as que visam o skipping de exões com mutações framedisrupting do pré-mRNA, que apesar de introduzirem deleções, conseguem gerar transcritos in-frame permitindo a síntese de uma proteína, que mesmo sendo mais pequena, consegue ser funcional. Na terapia desta patologia, o skipping de um exão mediado por oligonucleotídeos antisense (AONs) pode restaurar a open reading frame (ORF) e permitir a síntese de uma proteína parcialmente funcional. O skipping de um exão pode ser induzido pela ligação de oligonucleotídeos antisense, direcionados para um ou ambos os locais de splice ou sequências internas do exão. Teoricamente, a correção da reading frame pode ser conseguida com o skipping de um ou mais exões que flanqueiem a deleção, ou com o skipping de exões in-frame que contenham mutações nonsense, ou com o skipping de exões duplicados. Os oligonucleotídeos antisense Drisapersen (com a estrutura química 2’-O-metil) e Eteplirsen (com a estrutura química morfolino) estão atualmente a ser testados em ensaios clínicos de Fase III como terapia para a Distrofia Muscular de Duchenne, e a aguardar aprovação da Agência Europeia de Medicamentos (EMA) e da Federal Drug Administration (FDA). Estes oligonucleotídeos antisense conseguem restaurar a reading frame da distrofina promovendo o skipping do exão 51 do gene da distrofina, sendo esta abordagem aplicável a aproximadamente 13% dos pacientes que sofrem desta patologia. Uma vez que os oligonucleotídeos antisense, que têm sido estudados e que avançaram para ensaios clínicos, têm mostrado um sucesso limitado no que diz respeito a eficácia clínica, neste trabalho procuramos testar a utilização de um diferente tipo de oligonucleotídeos: oligonucleotídeos modificados com Locked Nucleic Acid (LNA) – LNA-AONs, como nova estratégia para alcançar a correção do gene mutado, resgatando a expressão da proteína distrofina, induzindo o skipping direcionado do exão 51. Procurámos descobrir se estes LNA-AONs podem ser utilizados para terapias de modulação de splicing com aumento da eficiência. Os nucleótidos LNA possuem uma unidade de açúcar alterada que forma uma ponte metileno. Esta modificação permite propriedades melhoradas em termos de aumento de estabilidade de hibridação com a sequência alvo, de alta sensibilidade, boa descriminação de incompatibilidades (mismatches), baixa toxicidade e estabilidade metabólica aumentada, ajustando às propriedades necessárias para terapia humana. Neste trabalho, linhas celulares derivadas de mioblastos de pacientes com DMD e indivíduos normais (Mamchaoui, K. et al, 2011) foram utilizados para indução in vitro de skipping do exão 51 do pré-mRNA da distrofina e o modelo animal mdx52 (Aoki, Y. et al, 2012), ratinhos que apresentam uma deleção do exão 52 no gene DMD, foi utilizado para indução in vivo de skipping do exão 51 do pre-mRNA da distrofina nos tecidos musculares. Pesquisámos skipping do exão 51 ao nível dos transcritos, através da utilização de técnicas de RT-PCR e pesquisámos a restauração da produção da proteína, através da utilização de técnicas de Western Blot e Imunofluorescência. Os nossos resultados mostraram skipping eficaz do exão 51 e restauração da produção da proteína distrofina em mioblastos distróficos de pacientes, transfectados com oligonucleotídeos modificados com LNA utilizando concentrações tão baixas como 5nM. No modelo animal, o ratinho mdx52, após cinco injeções intravenosas na cauda, a cada duas semanas, com 1mg/kg de LNA-AON, duas semanas após a última injeção, não foi detetado skipping do exão 51 por RT-PCR, nem proteína via Western Blot. No entanto, aglomerados de fibras positivas para a distrofina foram detetadas por imunohistoquímica em ratinhos mdx52 tratados,e não em ratinhos injectados como controlo, levando a crer que são fibras em que a produção de distrofina foi induzida terapeuticamente devido ao LNA-AON usado. Ocasionalmente, observamos a presença de fibras positivas isoladas para a distrofina em ratinhos não tratados, no entanto nestes casos estamos perante fibras revertentes, ou seja, fibras isoladas ocasionais que ocorrem naturalmente e parecem expressar distrofina corretamente localizada. Estas fibras revertentes poderão ser exemplos onde, por acaso, mutações secundárias adicionais ou eventos intrínsecos aberrantes de splicing proporcionam o skipping de um ou mais exões adicionais de forma a restaurar a reading frame correta original, permitindo a produção de uma proteína funcional. Para que ocorra uma reversão do fenótipo da DMD para um fenótipo menos severo, como o da BMD, ou para evitar distrofias musculares em humano e ratinho, é necessária a expressão de níveis de 20 a 30% da distrofina normal no tecido muscular. O objetivo deste projeto foi testar se LNA-AONs poderiam ser utilizados para terapias de modulação splicing com maior eficiência, em relação aos AONs já estudados. Nós demonstramos que o resgate de expressão de distrofina realizando o skipping do exão 51 é viável em linhas celulares derivadas de mioblastos in vitro, e em ratinhos mdx52 distróficos in vivo. Os resultados apresentados, obtidos com o modelo celular, parecem muito promissores, a fim de alcançar uma boa recuperação da proteína distrofina em mioblastos de doentes DMD bem como os alcançados em em ratinhos mdx52. Seguidamente será necessária otimização do sistema de entrega dos oligonucleotídeos para o tecido muscular de forma generalizada, uma vez que o tratamento de todo o organismo é um desafio e que os tecidos envolvidos são pósmitóticos, sendo aproximadamente 30 a 40% do corpo humano constituído por músculo. A melhoria da eficiência de modulação de splicing e da biodistribuição de oligonucleotídeos antisense (AONs) pode reduzir a dose terapêutica e intervalo das administrações, minimizando a potencial toxicidade, efeitos off-target, e custos. Com este trabalho mostrámos a aplicabilidade de pequenos oligonuleótidos LNA modificados para terapia genética da Distrofia Muscular de Duchenne, abrindo caminho para uma pesquisa de métodos mais eficientes para terapia genética por modulação de splicing em tratamento sistémico de uma doença genética hereditária.
Genetic disorders are caused by abnormalities in an individual’s DNA. Novel therapeutic strategies for this types of diseases have been emerging, especially on therapies that involve the modulation of disease-related gene expression. Modulation of splicing using antisense oligonucleotides (AONs) is feasible in vitro and can have possible therapeutic applications. The most notable example is in Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), a genetic hereditary disease caused mainly by frame-shifting or nonsense mutations in the DMD gene in chromosome X, which encodes for the dystrophin protein, essential for membrane stability of muscle fibers. In DMD cells, antisense-mediated exon skipping can restore the open reading frame and allow synthesis of partly functional dystrophin proteins instead of non-functional proteins, transforming DMD in the milder Becker Muscular Dystrophy (BMD). The antisense oligonucleotides Drisapersen (2’-O-methyl chemistry) and Eteplirsen (morpholino chemistry) are currently being tested in clinical trials as a therapy for DMD. These aim to restore the dystrophin reading frame by promoting skipping of exon 51, an approach that is applicable to approximately 13% of DMD patients. Locked Nucleic Acid (LNA) modified oligonucleotides carry an altered sugar moiety that forms a methylene bridge allowing improved properties in terms of increased duplex stability, high sensitivity, good mismatch discrimination, low toxicity and increased metabolic stability, fitting the properties needed for human therapy. An oligonucleotide wuth this chemistry is currently awaiting for clinical application as HCV infection therapy after good results in clinical trials. We aim to test if LNA oligonucleotides (LNA-AON) can be used for splicing modulation therapies, with increased efficiency. In this work, myoblast derived cell lines from patients and mdx52 mice were used for in vitro and in vivo induction of skipping of DMD-exon 51, respectively. We looked for skipping of exon 51 at the transcript level (RT-PCR) and for restoration of protein production (Western Blot and Immunofluorescence). Our results show effective skipping of exon 51 and restoration of dystrophin protein production in dystrophic myoblasts transfected with the LNA-AON at concentrations as low as 5nM. In the animal model, the mdx52 mouse, after five biweekly tail intravenous injections of 1mg/kg with the LNA-AON, we were able to visualize clusters of dystrophin positive fibers therapeutically induced by the LNA-AON on cryosections of selected muscles. With this work we showed the applicability of short LNA-modified oligonucleotides for Duchenne Muscular Dystrophy gene therapy, paving the way for a search of more efficient methods for gene therapy splicing modulation in systemic treatment of an inherited genetic disease.
