New data on the reprovative strategy of Squalius alburnoides complex: a histological and molecular approach

• Author(s): Machado, Miguel Paulo, 1987-
• Date: 2010
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/2411
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Ictiologia; Hibridação; Citogenética; Teses de mestrado - 2010
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Coelho, Maria Manuela, 1954-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010

A determinação/diferenciação sexual em peixes teleósteos tem suscitado grande interesse devido à grande diversidade de mecanismos que têm sido descritos, sendo estes constantemente reinventados, mesmo entre espécies irmãs. A poliploidia e a hibridação correspondem a importantes factores na evolução e especiação de vertebrados, levando frequentemente a uma alteração brusca das redes regulatórias da expressão génica. O complexo ciprinícola Squalius alburnoides surge, deste modo, como um modelo interessante para endereçar questões relacionadas com a determinação/diferenciação sexual num contexto alopoliplóide. Tratando‐se de um peixe dulçaquícola endémico da Península Ibérica, S. alburnoides teve origem num processo de hibridação resultante de cruzamentos intergenéricos entre a espécie Squalius pyrenaicus (ancestral materno, genoma P) e uma espécie presumivelmente extinta da linhagem de Anaecypris hispanica (ancestral paterno, genoma A). Este complexo compreende várias formas que variam na sua ploidia (2n, 3n e 4n) e constituição genómica (PA, PAA, PPA, PPAA, nas populações do sul). Squalius alburnoides apresenta ainda uma forma diplóide de composição nuclear não híbrida (AA) constituída apenas por machos. Actualmente, o complexo S. alburnoides encontra‐se em simpatria com outras espécies de Squalius (S. pyrenaicus, S. carolitertii e S. aradensis) que participam activamente na dinâmica reprodutiva do complexo, intercruzando‐se com as várias formas do mesmo. Estudos recentes comparativos da expressão génica entre as diferentes formas do complexo revelaram a existência de um mecanismo de compensação de dosagem em S. alburnoides que reduz os níveis dos transcritos das formas poliplóides para o nível encontrado nas formas diplóides. Os mesmos estudos sugeriram ainda que, nas formas triplóides das bacias hidrográficas do Sul, os alelos do genoma menos representado estão a ser preferencialmente silenciados. No entanto, um cenário diferente foi encontrado nas populações do Norte, tendo os indivíduos uma expressão quase sempre bialélica, independentemente da sua constituição genómica. Relativamente à determinação/diferenciação sexual neste complexo alopoliplóide, alguns estudos foram realizados para avaliar quais os genes envolvidos na regulação do processo de manutenção de identidade da gónada neste organismo e na espécie parental simpátrica S. pyrenaicus. Hibridação in situ dos genes amh, dmrt1, wt1, dax1, figlα e aromatase (estudados em outros vertebrados) não revelou uma expressão dimórfica entre sexos, nem um padrão diferente entre indivíduos do complexo hibridogenético e de S. pyrenaicus. Recentemente foi reportada a ocorrência de hermafroditismo em S. alburnoides, factor relevante na interpretação de resultados de expressão dos genes ligados ao sexo. No presente trabalho pretendeu‐se esclarecer algumas dúvidas que ainda restavam sobre o hermafroditismo no complexo S. alburnoides, nomeadamente, se este seria um estado de transição num contexto de hermafroditismo sequencial e se seria extensível a outras populações e, inclusivamente, a outras espécies de Squalius. Para este fim, efectuou‐se uma série temporal de amostragens na bacia hidrográfica do Guadiana (onde anteriormente tinha sido observado o fenómeno), para além de capturas pontuais noutras bacias hidrográficas. Uma das gónadas de cada indivíduo foi processada para histologia e a outra, sempre que necessário, para extracção de RNA e subsequente análise dos níveis de expressão dos v genes dmrt1, figlα e sox9a. Esta metodologia permitiu despistar possíveis desvios da expressão esperada dos genes devido à influência do hermafroditismo. Note‐se que o gene sox9a foi isolado e analisado pela primeira vez no complexo S. alburnoides e na espécie S. pyrenaicus. A análise histológica da morfologia das gónadas recolhidas anteriormente permitiu averiguar o seu estado de maturação nas diferentes formas do complexo, bem como na espécie simpátrica S. pyrenaicus. A análise dos resultados obtidos revelou uma interessante correlação entre os estados de maturação e a expressão dos genes analisados em trabalhos anteriores e no presente. Assim, foi observado que indivíduos cuja expressão do genoma P é inevitável, como a espécie S. pyrenaicus e as formas PA e PPA, apresentam oócitos imaturos até mais tarde, comparativamente com as formas triplóides PAA que, tendencialmente, apresentam apenas transcritos do genoma A. Este possível alargamento da época de reprodução das fêmeas diplóides em particular, juntamente com o facto de produzirem um maior número de ovos comparativamente às fêmeas triplóides, poderá contribuir para a elevada proporção de indivíduos triplóides nas populações naturais do complexo, uma vez que a sua descendência será maioritariamente triplóide, tendo em conta as formas mais frequentes e os seus modos de reprodução. Ao longo dos vários meses de amostragem, através das observações histológicas, foi encontrada uma massa celular nas proximidades do tecido reprodutor masculino e feminino dos indivíduos das diferentes populações de S. alburnoides e S. pyrenaicus estudadas. O conhecimento prévio da ocorrência de hermafroditismo em S. alburnoides levou a suspeitar que esta massa celular correspondesse a tecido reprodutor masculino. No entanto, a presença do mesmo também em machos levantou algumas dúvidas quanto à sua possível origem. Nas fêmeas, vários factores parecem indicar indirectamente tratar‐se de um verdadeiro tecido masculino, nomeadamente, a) o facto de neste sexo a massa celular parecer acompanhar o ciclo de maturação da gónada feminina, alterando a sua cor e complexidade; b) ter sido encontrado verdadeiro tecido testicular maduro numa fêmea; e c) os níveis de expressão diferencial dos genes dmrt1 e figlα (respectivamente, masculino e feminino, como referido posteriormente) em diferentes porções de uma mesma gónada. À semelhança de outros vertebrados, a expressão do gene figlα revelou ser caracteristicamente feminina, possuindo as fêmeas maior quantidade de mRNA deste gene do que os machos. Comparando as diferentes formas de fêmeas, uma maior expressão deste gene parece existir nas fêmeas diplóides. Esta diferença poderá dever‐se ao facto deste gene ser expresso em oócitos imaturos e estar descrito que esta forma possui maior número de oócitos. Os níveis de expressão do gene dmrt1 revelaram‐se, por sua vez, caracteristicamente masculinos, possuindo os machos maior expressão que as fêmeas, resultados que se encontram em concordância com o seu papel fundamental na diferenciação e manutenção da gónada masculina em outros vertebrados. No presente trabalho, o gene ortólogo sox9a foi isolado em S. alburnoides e S. pyrenaicus e a sua expressão averiguada. A análise dos níveis de expressão deste gene revelou uma possível variação populacional interessante. Verificou‐se que nas populações do Sul filogeneticamente próximas, nomeadamente, Sado, Guadiana e Almargem, este gene se apresentava mais expresso nos machos, sendo encontrado um cenário completamente oposto nas populações mais distantes (Cobrão, Raia e Colares), nas quais o gene é mais expresso nas fêmeas. vi A confirmar‐se verdadeiramente a natureza masculina da massa celular observada nas fêmeas, esta não será resultado de um estado de transição entre sexos num contexto de hermafroditismo sequencial. Assim, uma estratégia reprodutora androdióica (ou, pelo menos, trióica) parece mais provável de estar a ocorrer em S. alburnoides e, possivelmente, ser extensível a outras espécies de Squalius. A evolução destas estratégias reprodutora no complexo S. alburnoides é facilmente entendível devido ao enviesamento sexual para fêmeas triplóides, uma vez que a existência de hermafroditas poderá aumentar a produção de descendência numa população, reduzindo a dificuldade em encontrar parceiros sexuais. A vantagem adaptativa desta característica em S. pyrenaicus é menos clara, uma vez que esta espécie tem sido descrita como tendo um rácio sexual equilibrado. No entanto, vários factores importantes para a compreensão da evolução do hermafroditismo nesta espécie são ainda desconhecidos, nomeadamente, o seu comportamento social e sistemas de acasalamento.