Characterization by HPLC of phytoplankton and microphytobenthos photosynthetic pigments

• Author(s): Ruivo, Michael Philippe Marquês, 1986-
• Date: 2010
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/2415
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Fisiologia vegetal; Fitoplâncton; Pigmentos; Teses de mestrado - 2010
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Cartaxana, Paulo, 1970-; Amorim, Ana, 1960-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Ecologia Marinha). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010

As zonas costeiras são regiões de enorme produtividade, demonstrando elevada diversidade de organismos de fitoplâncton e de microfitobentos. A biomassa e produção destes organismos autotróficos são afectadas, entre outros factores, pela disponibilidade de luz e nutrientes. As clorofilas, carotenóides e ficobilinas são os principais tipos de pigmentos fotossintéticos, sendo essenciais à fotossíntese. A cromatografia líquida de alta precisão (HPLC) é uma técnica que permite a análise qualitativa e quantitativa dos vários pigmentos fotossintéticos, disponibilizando informações acerca de biomassa, composição e estado fisiológico das comunidades de fitoplâncton e de microfitobentos. Capítulo 2 Neste capítulo estudaram-se os efeitos das fases de crescimento, exponencial e estacionária, e da irradiância nas concentrações e razões pigmentares em espécies fitoplanctónicas. No estudo do efeito da fase de crescimento foram utilizadas sete espécies, entre elas dois dinoflagelados, Amphidinium carterae e Gymnodinium catenatum, uma clorofícea, Dunaliella salina, uma prasinofícea, Tetraselmis suecica, duas diatomáceas, Cylindrotheca closterium e Phaeodactylum tricornutum, e uma criptofícea, Rhodomonas sp. Após realização das curvas de crescimento, amostraram-se três réplicas em fase exponencial e três réplicas em fase estacionária. No estudo do efeito da irradiância nas concentrações e razões pigmentares usaram-se 3 espécies, A. carterae, C. closterium e T. suecica, submetidas a três níveis de irradiância (Luz Baixa, LL = 10 μmol fotões m-2 s-1; Luz Média, ML, 100 μmol fotões m-2 s-1; Luz Alta, HL, 400 μmol fotões m-2 s-1). Amostraram-se três réplicas em fase exponencial para cada nível de irradiância. A análise e caracterização pigmentar das várias espécies foi efectuada por HPLC. A comparação entre as fases de crescimento exponencial e estacionária demonstrou a existência de diferenças significativas tanto nas concentrações como nas razões pigmentares. As concentrações de pigmentos fotossintéticos por célula (e.g. clorofila a, clorofila b, fucoxantina e neoxantina) foram superiores durante a fase de crescimento exponencial. Tais resultados podem ser consequência da limitação de nutrientes e/ou da idade celular durante a fase estacionária. Por sua vez, obtiveram-se, consistentemente, maiores concentrações de anteraxantina, diatoxantina e zeaxantina durante a fase estacionária, demonstrando que pigmentos tipicamente com função fotoprotectora tendem a aumentar a sua concentração quando as células entram nesta fase, provavelmente devido ao seu envolvimento na prevenção foto-oxidativa das células. Os ratios pigmento/clorofila a, (exceptuando a violaxantina e o β-Caroteno), violaxantina + anteraxantina + zeaxantina (VAZ)/clorofila a e diadinoxantina + diatoxantina (DD + DT)/clorofila a e os índices de de-epoxidação (DPS) foram sistematicamente superiores durante a fase estacionária. Verificaram-se diferenças inter-específicas para espécies pertencentes ao mesmo grupo taxonómico. Em C. closterium a razão fucoxantina/clorofila a não variou significativamente enquanto em P. tricornutum esta razão foi aproximadamente o dobro na fase estacionária. Nos dinoflagelados, a razão peridinina/clorofila a aumentou menos de 25% entre as fases exponencial e estacionária, todavia essas diferenças só foram significativas em A. carterae. O efeito da irradiância foi significativo nas concentrações dos pigmentos de colheita de luz (LHP) e pigmentos fotoprotectores (PP). As maiores concentrações de LHP ocorreram em LL, intermediárias em ML e finalmente mais baixas em HL. Esta diminuição na concentração de LHP com o aumento da intensidade luminosa é devido à fotoaclimatação das células regulada pelo tamanho das antenas fotossintéticas. Pelo contrário, os PP apresentaram maiores concentrações em HL e menores em LL. A de-epoxidação de violaxantina em anteraxantina e zeaxantina e de diadinoxantina em diatoxantina (ciclo das xantofilas), regula o excesso de energia, consequência do aumento da irradiância, através da dissipação de calor, permitindo a protecção do aparelho fotossintético. Genericamente, as razões de pigmentos com função fotossintética, e embebidos nos complexos de colheita de luz, foram constantes nas diferentes irradiâncias, pois tendem a co-variar com a clorofila a. No entanto, as razões de pigmentos com função protectora foram superiores em HL (e.g. luteína e zeaxantina). No capítulo considerado demonstrou-se o efeito significativo da fase de crescimento e da luz nas razões pigmento/clorofila a. Assim sendo, estas variáveis devem ser consideradas na aplicação dos pigmentos fotossintéticos como indicadores quimiotaxonómicos para o estudo de comunidades fitoplanctónicas. Capítulo 3 Os objectivos deste estudo foram direccionados para a comparação da fotoprotecção fisiológica (utilização dos ciclo das xantofilas como forma de dissipação do excesso de energia no aparelho fotossintético) e comportamental (capacidade de migração vertical que permite às microalgas o controlo do nível de irradiância a que estão expostas) entre comunidades epipélicas e epipsâmicas de substrato vazoso e arenoso no estuário do Tejo. Amostraram-se dois locais: um tipicamente constituído por partículas de dimensões inferiores a 63 μm (denominado vasa), e outro com partículas de calibre entre 125 e 1000 μm (referido como areia). Assim sendo, aspectos como fluorescência, atenuação da luz, curvas rápidas de luz, análise e caracterização pigmentar e avaliação da capacidade migratória foram estudados recorrendo a técnicas de fluorescência de Pulso Modulado (PAM) e HPLC. Na comparação entre as comunidades epipélicas e epipsâmicas verificaram-se diferenças nos diversos parâmetros estudados. Na comunidade de substrato vazoso, denotou-se um efeito da profundidade nos perfis de clorofila a e uma diminuição da concentração de clorofila a ao longo do perfil. O coeficiente de atenuação da luz (k) foi elevado, com um decréscimo na disponibilidade da luz para 33%, 7% e 1% da luz incidente à superfície a profundidades de 200, 400 e 600 μm, respectivamente. Na comunidade de substrato arenoso, não se verificaram diferenças significativas nas concentrações de clorofila a, sendo estas constantes ao longo do perfil. O coeficiente de atenuação de luz foi inferior, comparativamente ao valor obtido no substrato vazoso, com 80%, 50% e 2% de disponibilidade de luz a profundidades, de 200 μm, 400 μm e 3000 μm, respectivamente. As diferenças de k e da concentração de clorofila a ao longo dos perfis de sedimento são devido ao tamanho das partículas, provocando assim, uma diferenciação na distribuição vertical das comunidades bênticas. O calibre das partículas de sedimento e k variam de forma inversamente proporcional. Em substrato vazoso, ocorreu uma diminuição de clorofila a à superfície (0-200 μm) no controlo sob luz alta (Cont HL) quando comparado com luz baixa (LL) e sedimentos tratados com um inibidor de motilidade (Lat A HL). Em simultâneo, observou-se um aumento da percentagem relativa de clorofila a na camada de 200-400 μm. Tal situação, não se verificou em Lat A HL devido à presença do inibidor de motilidade, prevenindo a migração. Estes resultados indicam que as diatomácias epipélicas da vasa submetidas a luz forte migram em profundidade – fotoprotecção comportamental – e corrobora a função de Lat A como um inibidor altamente específico de motilidade em diatomácias. Ambas comunidades estudadas activaram mecanismos fisiológicos de fotoprotecção quando sujeitas a luz forte. No substrato vazoso o índice DPS foi superior em Lat A HL quando comparado com LL (estrato 0-200 μm), mas sem diferenças significativas entre Lat A HL e Cont HL. No substrato arenoso o índice DPS foi inferior para LL, intermédio para Cont HL e superior em Lat A HL. Estes resultados indicam diferenças significativas com Cont HL. A interpretação destes resultados sugere que as comunidades pertencentes aos substratos vazoso e arenoso recorrem ao ciclo das xantofilas como mecanismo de fotoprotecção, independentemente da sua capacidade migratória. Na avaliação da influência dos diferentes tratamentos nos vários parâmetros das curvas rápidas de resposta-luz (taxa máxima relativa de transporte de electrões -rETRmax; declive inicial da taxa fotossintética não saturada - α; parâmetro de saturação de luz - Ek) denota-se um efeito significativo dos vários tratamentos, para ambos substratos em rETRmax, α e Ek. A excepção ocorre no substrato arenoso para Ek, onde não existem diferenças significativas. Porém, no substrato vazoso, os valores de rETRmax, α e Ek foram significativamente mais baixos em Lat A HL que em Cont HL enquanto essas diferenças não foram significativas no substrato arenoso. Estes resultados são consequência das diferentes condições de luz na matriz sedimentar dos substratos estudados, e provavelmente devido a diferenças na composição taxonómica. Este trabalho demonstra as diferentes respostas das células às variações de luz no sedimento: i) através de fotoprotecção fisiológica (ciclo das xantofilas) e/ou ii) movimento vertical descendente ao longo do perfil de sedimento, denominado fotoprotecção comportamental. As comunidades epipélicas, por apresentarem capacidade migratória, utilizam tanto a fotoprotecção fisiológica como comportamental, enquanto as comunidades epipsâmicas, sem capacidade migratória, valem-se apenas de fotoprotecção fisiológica.

Phytoplankton and microphytobenthos communities influence coastal systems productivity and are affected, among other factors, by light and nutrients availability. Growth phase and light variation effect on phytoplankton pigment concentrations and physiological vs. behavioral photo-protection of epipelic and epipsamic microphytobenthos communities were studied using High Performance Liquid Chromatography. Growth phase and light variation showed a significant effect on phytoplankton light harvesting (LHP) and photo-protective (PP) pigments. LHP concentrations were lower during stationary growth phase presumably by nutrient limitation and cellular age whereas photo-protective pigments increased. An increment of pigment ratios from exponential to stationary phase was consequence of the pronounced decrease in chlorophyll a cellular content comparatively with other pigments. Light increase lead to a decrease on photosynthetic pigment concentrations due to cellular photoacclimation, while the photo-protective pigment concentrations increase, allowing the dissipation of excess energy. This study shows that growth phase and light intensity have significant effects on pigment/Chl a ratios, including many marker pigments, and this should be taken into account in the application of chemotaxonomical approaches to phytoplankton natural communities. Microphytobenthos biomass vertical distribution in intertidal mud and sandflats of the Tagus estuary was considerably different depending on the type of sediment. In the mud, a steep decrease in biomass accumulation from the surface down to 1 mm was observed, whereas in the sand Chl a concentrations were relatively stable throughout the profile. Epipelic and epipsamic communities showed different photo-regulaton strategies: both communities photo-regulated using physiological photo-protection while the epipelic community of muddy sediments used physiological and behavioral photoprotection.