Author(s): Ventosa, Miguel André Lourenço da Luz, 1987
Date: 2010
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/2441
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Biotecnologia; Medicago truncatula; Melhoramento vegetal; Teses de mestrado - 2010
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
As leguminosas são um importante grupo de cultivares, utilizadas como alimento humano e animal, principalmente devido ao seu alto conteúdo proteico. A informação disponível sobre leguminosas modelo como Medicago truncatula e Lotus japonicus nos últimos anos tem melhorado consideravelmente a nossa compreensão sobre a estrutura do genoma, função de gene e de proteínas, das leguminosas em geral. A sequenciação de genomas em grande escala, bem como a anotação de genes tem evoluído, permitindo uma alta resolução em abordagens de comparações genómicas ou proteómicas. M. truncatula tem um pequeno genoma diplóide (2n = 16), um ciclo de vida rápido, é autogâmica produzindo um número razoável de sementes. Esta planta tem também um tamanho reduzido e é passível de transformar geneticamente. O laboratório de biotecnologia de células vegetais do ITQB/UNL utiliza a linha M9-10a da cultivar Jemalong para diversos estudos. Um desses estudos é a indução de embriogénese somática nos folíolos dessa mesma linha, na presença de dois fitorreguladores, 0.4 μM ácido 2,4-diclorofenoxiacético (auxina) e 0.9 μM zatina (cinetina). Ao contrário da embriogénese zigótica, a embriogénese somática ocorre sem a necessidade de fecundação gamética. Este potencial constitui a demonstração mais clara da totipotência das células vegetais que pode ter importantes aplicações práticas, como por exemplo, a propagação de plantas em larga escala e a regeneração a partir de células geneticamente transformadas. O processo pelo qual células somáticas se tornam células embriogénicas implica três etapas principais: indução, proliferação e diferenciação. O processo tem início com a execução de cortes transversais nos folíolos e com a colocação desses mesmos folíolos em meio indutor. Após os primeiros dois a cinco dias, as células proliferam até que apenas se observe uma imensa massa calosa de modo a que seja pouco perceptível que aquele material derivou de folíolos. Nesse momento, o material é composto por um grupo de células vegetais indiferenciadas com uma cor ligeiramente esverdeada. Após catorze dias de cultura, começamos a notar o aparecimento de massas pré-embriogénicas. Esta etapa corresponde ao início do processo de diferenciação, onde com o decorrer do tempo observamos as massas pré-embriogénicas dando origem a embriões em desenvolvimento. Ao final de mais cinco dias de cultura, observa-se na periferia do material caloso, vários embriões numa fase globular ou em forma de coração, originando cada um, uma nova planta. A capacidade de gerar vários embriões está presente na linha M9-10a, que foi isolada a partir de uma linha não embriogénica, M9, estando também ao nosso dispôr. O objectivo deste trabalho é identificar as proteínas que estão relacionadas com a regulação da indução de embriogénese somática em M. truncatula. Para isso o tecido da amostra foi colectado de folíolos em meio de indução, em diferentes tempos (0, 2, 5, 14, 21 dias). O material vegetal foi cuidadosamente recolhido, tendo havido uma selecção das novas células que se desenvolveram. As proteínas foram extraídas por um protocolo de precipitação com ácido triclorocético e acetona melhorámos o processo de extracção face desafios do novo processo de recolha. As proteínas, foram marcadas com vários corantes fluorescentes (que têm excitação e espectros de emissão distintos) e resolvidas quer pelo seu pI (ponto isoelétrico) que pela sua MM (massa molecular) numa abordagem 2D-DIGE. A técnica de DIGE implica que em cada gel electroforético são corridas ao mesmo tempo três grupos de proteínas (duas amostras únicas e uma mistura de todas as amostras em análise), marcadas com três fluoróforos diferentes (Cy2, Cy3 e Cy5). Esta técnica é muito sensível e permite reduzir o erro técnico em trabalhos de expressão diferencial de proteínas. Torna-se então, uma abordagem poderosa para a selecção de proteínas realmente envolvidas no nosso processo biológico. A análise dos géis foi feita com recurso ao software Progenesis SameSpots (Nonlinear Dynamics), revelando aproximadamente 1300 “spots” individualizados. Desse total de proteínas, diferentes grupos foram considerados a fim de se proceder ao tratamento estatístico através de ANOVA. Para identificar as proteínas em questão gerámos uma lista de coordenadas que continha todas as proteínas diferencialmente expressas em qualquer planta, em qualquer ponto de amostragem, dando um total de 545. Essa lista de coordenadas foi introduzida num “spot picker” que isolou os pedaços de gel contendo as proteínas de interesse. Como a digestão e análise de todas essas proteínas em tempo útil seria bastante difícil, procedeu-se a escolha de 174 proteínas para a continuação do nosso trabalho, envolvendo: digestão tríptica, análise num espectrómetro de massa (MALDI TOF-TOF) e identificação de proteínas nas bases de dados. No total, tivemos uma taxa de identificação de 43%. Comparámos tanto a linha M9-10a versus M9 em cada tempo de amostragem, como cada uma destas linhas no decorrer do tempo de cultura. Observámos que, mesmo antes de ambas as linhas serem submetidas ao processo de embriogénese, ambas apresentam diferenças ao nível de proteínas. O número de proteínas diferencialmente expressas é gradualmente reduzido ao longo dos três primeiros tempos. Esta fase corresponde à etapa de proliferação e no dia cinco apenas apresenta três proteínas diferencialmente expressas. Já na presença de massas embriogénicas, a linha M9-10a apresenta um padrão de expressão bastante distinto da linha M9. Existe um elevado número de proteínas que apresentam um pico de expressão por volta deste tempo (catorze dias), tendo provavelmente uma influência directa no aparecimento das massas pre-embriogénicas, que originarão embriões. Por outro lado a linha M9 tem várias proteínas a aumentar gradualmente de expressão entre os dias cinco e vinte e um, o que provavelmente corresponde a proteínas de senescência celular, visto os tecidos do callus desta linha apresentarem na fase final do tempo de recolha, tecidos amarelados, acabando eventualmente por morrerem. Com um maior detalhe foram discutidos os padrões de expressão das proteínas nucloside diphosphate kinases, PAP fibrillins e transposases. Com a continuação deste trabalho, identificando a maioria do restante número de proteínas, esperamos estar na condição de descrever com maior detalhe a regulação de proteínas e vias metabólicas relacionadas com a resposta embriogénica contribuindo assim para o aperfeiçoamento de várias espécies de plantas leguminosas e simultaneamente para um melhoramento da nutrição humana e animal.
Legumes are a major crop plants group used as both human food and animal feed, mainly because of the high protein content in pasture and fodder species. The use of model legumes like Medicago truncatula or Lotus japonicus over the last years has dramatically improved our understanding of the genomic structure, gene function and protein content of legumes in general. Large-scale genomic sequencing and gene annotation is well advanced for both model legumes, thus allowing high resolution comparative genomics and proteomics approaches. M. truncatula has a small diploid genome (2n = 16), a rapid life cycle; is autogamous and produces a fair number of seeds. Additionally, plants have a reduced size and are amenable for genetic transformation. The Plant Cell Biotechnology Lab at the ITQB/UNL uses the M9-10a line of the cultivar Jemalong for several studies. One of these studies is the embryogenic response of leaves in the presence of some phytoregulators. The ability of generating several embryos is present in the line M9-10a, which was isolated from a non-embryogenic line - M9 - also available at the ITQB. The goal of this work is to identify which proteins are related with the regulation of the induction of somatic embryogenesis in M. truncatula. Sample tissue was collected from leaflets induction medium at several time points (0, 2, 5, 14, 21 days). The plant material was meticulously collected and proteins extracted by TCA precipitation protocol. The proteins, labelled with fluorescent cyanine dyes (which have distinct excitation and emission spectra) were separated according to the pI (Isoelectric point) and Mm (molecular mass) in a 2D-DIGE approach (DIGE stands for “differential gel electrophoresis“). This technique is very sensitive and reduces non-biological variation in differential protein expression experiments. Therefore it is a powerful approach to select, with high confidence, proteins truly involved in a given biological process. The end point of this work was the identification of 74 differentially expressed proteins by Mass Spectrometry analysis using a MALDI-TOF-TOF 4800 apparatus and database inference in a “bottom-up” strategy. We have seen that the at the beginning the two lines have differences at the protein level. Those differences are reduced by the number of differentially expressed proteins in the proliferation stage and then increase again. We have looked at protein expression patterns and discuss a possible role of nucloside diphosphate kinases, PAP fibrillins and transposases in the somatic embryogenic process.
