Genotypic and phenotypic characterization of HIV-1 virus found early in infection

• Author(s): Freitas, Inês Trindade de, 1986-
• Date: 2010
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/2501
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Biologia molecular; HIV; Manipulação genética; Teses de mestrado - 2010
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Sagar, Manish; Caeiro, Filomena, 1950-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Humana). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010

In this study we raised full-length envelope sequences from HIV-1 infected patients in early phases of infection, up to three month of viral acquisition, and from their transmitting partners, who were in later stages of infection, to assess any genotypic signature(s) that would distinguish the envelope sequences that were being transmitted and correlate those signatures with viral co-receptor usage and with drugs and neutralization sensitivity. Briefly, we isolated RNA from patients plasma, retro-transcribed it into cDNA and amplified envelope. We used yeast gap repair to clone envelope sequences into our expression vectors. Vectors were then transformed into bacteria and isolated clones were subjected to PCR and sequenced. Despite small sample size, V3 loop and V1-V5 region length seem to be shorter in earlier viruses when compared to later viruses. No other fragments analyzed from envelope showed any trend to be shorter in earlier isolates; neither did full-length envelope, gp41 or gp120. Also, no statistically significant decrease in the number of potential N-glycosylation sites or on the sequences genetic distances was establish in earlier virus.

O Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH), causador da Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA), é um flagelo que já matou cerca de 25 milhões de pessoas desde que foi descoberto nos anos 80 (1). Com 100% de taxa de mortalidade, esta enfermidade não se lhe conhece cura nem medicamentos preventivos eficazes, pelo que a investigação deste patogénio se torna imperativa. O VIH pertence à família Retroviridae o que significa que o seu modo de transcrição é muito propício a erros, uma vez que a enzima transcriptase reversa não possui a capacidade de revisão de provas. Este aspecto aliado ao facto deste vírus ter um ciclo de replicação curto, uma taxa de recombinação elevada, uma imensa plasticidade genética e estar sob constante pressão selectiva, torna o versado em evasão. O genoma de VIH-1 origina um produto transcripcional primário gag, pol, env, que é traduzido em poliproteínas. Através de clivagem, estes fragmentos vão dar origem as proteínas maturadas de que os novos vírus necessitam para se tornar infecciosos, como enzimas e proteínas estruturais. O mesmo produto transcripcional através de splicing alternativo irá dar origem a transcritos que são traduzidos em proteínas acessórias como VPR, VIF, TAT, NEF,VPU e REV(i). Devido à enorme variabilidade que este vírus apresenta e devido ao facto de este ter transposto a barreira de espécies entre primatas e humanos em, pelo menos, três eventos isolados este encontra-se dividido em três clusters relativamente distintos: O (outlier), M (Main), N(Non M, non O). M é o mais representado mundialmente e subdivide-se adicionalmente em 9 subtipos e 43 formas recombinantes circulantes (CRF) (8). As diferenças observadas entre subtipos são significativas e os esforços para criação de uma vacina têm de considerar esses factos sob a pena de nunca ser possível criá-la. Em suma, novos estudos são urgentes para travar esta epidemia onde ela mais se faz sentir, África. Neste projecto propusemo-nos estudar genotipicamente o gene do invólucro viral, env, e correlacionar esses dados com aspectos fenotípicos do mesmo, como utilização de co-receptores, ou sensibilidade a drogas e a neutralização. Este gene está envolvido na entrada do vírus nas células, pelo que se assume ser o gene responsável pela transmissão. Este gene codifica para as duas subunidades do invólucro viral- gp41, subunidade transmembranar e gp120 subunidade de superfície. O invólucro funcional é um heterotrímero destas duas subunidades. A subunidade de superfície- gp120- é extremamente diversificada. Estando dividida em regiões constantes (C1-C6) e regiões variáveis (V1-V5) que se encontram sob a forma de protrusão. As regiões variáveis são ainda caracterizadas por terem mutações indel, por oposição às regiões constantes e à subunidade transmembranar do invólucro, gp41, cujas mutações são predominantemente pontuais. Esta proteína viral é ainda rica em glicosilação. Os glicanos vão proteger o vírus do reconhecimento imune e vão estar envolvidos na correcta conformação terciária da proteína. Assim, são também parcialmente responsáveis pela afinidade do vírus para o seu receptor-CD4- e para os seus co-receptores-CCR5 e CXCR4. Os genomas virais em estudo foram obtidos de casais heterossexuais em relações monógamas seleccionados de uma cohort de serovigilância no Uganda. Nesta região, em particular, os subtipos predominantes são o D, A e CRF AD, apesar destas proporções estarem em constante evolução. Sucintamente, um dos pacientes seria detectado nos três primeiros meses de infecção e em seguida, retrospectivamente, o parceiro responsável pela transmissão seria detectado e seria obtido o plasma de ambos os indivíduos. O último parceiro descrito estaria infectado há bastante mais tempo, não estando portanto na fase aguda da infecção. Com esta abordagem pretendemos, então, elucidar o mecanismo adjacente à transmissão de VIH-1, para os subtipos virais em questão. Brevemente, os genomas foram retro-transcriptos a partir de RNA extraído de plasma dos pacientes. O gene do invólucro foi amplificado através de nested PCR. O inserto de 2.5kb foi em seguida incorporado em levedura, para que através da técnica de yeast gap repair, descrita por Eric Arts (28), o fragmento fosse incorporado no nosso vector de expressão. O vector foi amplificado em bactéria. Não foi possível obter todas as sequências dos invólucros desta forma, uma vez que o env apresenta toxicidade em bactérias. Para tentar contornar este facto foi tentado obter o DNA directamente a partir das leveduras. Tentámos fazer colony PCR directamente das células de levedura, de forma a amplificar genomas isolados com o fim de sequenciá-los. Tentámos também fazer a extracção de DNA directamente a partir culturas de leveduras crescidas em meio líquido. Seguimos o protocolo descrito por Sobansky e Dickinson (29), e tentamos inúmeras alterações, sem resultados. Assim os únicos genes obtidos foram aqueles cuja toxicidade era aparentemente menor e cujas bactérias cresceram com o inserto. Desta forma a amostragem estatística ficou extremamente comprometida. Ainda assim, conseguimos em certos casos ver uma tendência estatística para a significância. Uma vez obtidas sequências, as distâncias genéticas foram analisadas. Sequências do parceiro nas fases iniciais da infecção não demonstraram ser menos diversificadas quando o teste de Mann-Whitney foi aplicado. Quando analisamos as sequências dos invólucros relativamente ao número de aminoácidos conseguimos ver então algumas tendências: o loop V3 e o fragmento V1-V5 aparentam ser mais curtos em sequências detectadas no início da infecção quando comparadas com sequências detectadas em indivíduos infectados há mais tempo. Esta mesma tendência não se verificou nas glicoproteínas inteiras, como a gp120 e gp41, nem em nenhuma outra porção do invólucro. Quanto aos locais de glicosilação nenhuma porção apresenta variabilidade com significância, no entanto, o loop V3 apresenta o p-value menor, de 0.19. Naturalmente estes resultados não se baseiam numa amostra suficientemente grande para serem significativos, mas propomos que as tendências observadas devam ser tidas em consideração. Estes resultados vêm corroborar, em parte, um estudo realizado por Sagar et al. (24) em que amostras de pares de transmissão heterossexual ugandenses também foram analisadas. No entanto, nesse estudo a população designada como inicial tinha uma média de 189 dias de infecção, média essa bastante mais elevada que na nossa amostra inicial. Nesse estudo, tal como no nosso, os padrões de glicosilação não apresentam diferenças significativas entre amostras iniciais e crónicas. No entanto, o loop V3 não apresenta a mesma tendência entre os dois estudos. Isto poderá dever-se à amostragem mais tardia do estudo de Sagar et al, pelo que se torna urgente compreender as características do invólucro viral em amostras o mais perto possível do momento de transmissão. Só desta forma será possivel desenvolver uma estratégia de prevenção da infecção eficaz.