Author(s): Martins, Nuno Filipe Gomes
Date: 2016
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/26352
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Parasitismo; Trade-off virulência-transmissão; Pseudomonas entomophila; Drosophila melanogaster; Genome Wide Association Study; Teses de mestrado - 2016; Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas
Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016
Parasitismo é uma interação que envolve dois organismos, um parasita, que retira vantagens da interação às custas do hospedeiro. Mais precisamente, o parasita utiliza os recursos do hospedeiro para seu proveito, sobretudo para se reproduzir e ser transmitido. Nesta interação o parasita devido à exploração dos recursos causa dano ao hospedeiro, ao que habitualmente se chama virulência. A virulência de um hospedeiro pode ser considerada uma característica que comprometa a interação e, assim, desvantajosa para o parasita. Seria, então, de esperar que houvesse uma seleção de parasitas que não causassem dano no seu hospedeiro. No entanto, se esta característica desvantajosa estiver correlacionada com uma característica vantajosa para o parasita, melhor se explicaria a existência de virulência em relações parasíticas. É a partir desta hipótese que surge a teoria do trade-off. A teoria do trade-off entre virulência e transmissão foi desenvolvido por Anderson e May, que no seu estudo correlacionam pela primeira vez o efeito do parasita no tempo de recuperação do hospedeiro. Esta hipótese defende a existência de uma relação de constrangimento entre as características de virulência e transmissão. Mais precisamente, que a virulência não pode aumentar indefinidamente sem comprometer a transmissão. O início da curva de trade-off é caracterizada por uma correlação positiva entre as duas características, em que o custo de aumentar a exploração dos recursos do hospedeiro, logo, a virulência, é acompanhado pelo aumento de transmissão. No entanto, esta curva satura, atingindo o valor ótimo, em que a transmissão é maximizada. A partir deste ponto o aumento da exploração de recursos leva a um aumento de virulência e a uma redução da transmissão, devido ao excesso de dano no hospedeiro pelo parasita, levando a que os hospedeiros morram antes do parasita ter oportunidade de se transmitir. Apesar da simplicidade da hipótese de trade-off, estudos que demonstrem esta correlação são escassos. O primeiro caso de estudo foi desenvolvido nas décadas de 50 e 60 por Fenner e colegas. Os resultados destes estudos sobre o vírus de mixomatose em populações naturais de coelhos europeus (Oryctolagus cuniculus), foram utilizados para fundamentar a hipótese do trade-off. Atualmente, novos estudos têm caracterizado a correlação entre virulência e transmissão em diversos sistemas, estudando a influência de diferentes estirpes de vírus e da interação com organismos vetores na infeção de hospedeiros. No presente trabalho, de modo a testar a teoria do trade-off entre transmissão e virulência, caracterizámos esta correlação numa população geneticamente variável de Drosophila melanogaster. Como patogénico, recorremos a uma estirpe de bactéria que infecta populações naturais do nosso organismo, Pseudomonas entomophila. Os principais objetivos da tese são: i. Desenvolver um novo protocolo que permita a medição de virulência e transmissão de um patogénio numa população outbred (com variabilidade genética) de D. melanogaster. E deste modo, caracterizar a relação entre as duas características no nosso complexo modelo. ii. Estudar o efeito de diferentes backgrounds genéticos do hospedeiro nas medições de virulência e transmissão. iii. Investigar as bases genéticas subjacentes aos fenótipos observados. Para o novo protocolo, adaptámos um protocolo estabelecido e anteriormente utilizado do laboratório, que apenas nos permitia medir virulência, de modo a medir as duas características na mesma população e geração. De modo a distinguir entre indivíduos utilizados para medir virulência e indivíduos para medir transmissão, recorremos a uma segunda população com um fenótipo facilmente distinguível da primeira. Estudámos a quantidade de bactéria presente em indivíduos infetados e caracterizámos a dinâmica da bactéria nas primeiras 72 horas após infeção. Observámos um decaimento constante da quantidade na população e o declínio do número de indivíduos infetados. Estes resultados vão de encontro a resultados anteriores que afirmam que a rápida eliminação da bactéria do sistema digestivo do hospedeiro contribui para a diminuição da mortalidade na população. Apesar da tendência de redução em toda a população, observamos a persistência de valores intermédios da quantidade de bactéria numa porção da população infetada (10%) nas últimas horas analisadas. Estes resultados parecem indicar a existência de tolerância no nosso sistema, visto que neste período a taxa de mortalidade é bastante reduzida. Devido a constrangimentos temporais, ao medir virulência e transmissão na população outbred, apenas medimos valores de virulência na parte inicial do espectro (Virulência: 0.5-38%; Transmissão: 3.125-66.67%). Observamos no nosso sistema uma correlação positiva entre as duas características, o que vai de encontro ao que é proposto na hipótese de trade-off, referente à parte inicial da curva, e a resultados de estudos anteriores. No entanto, os nossos resultados não demonstram uma saturação da curva, igualmente teorizado. Isto deve-se, provavelmente, á falta de mais informação, nomeadamente níveis de virulência mais elevados que, teoricamente, comecem a comprometer a transmissão. Uma outra hipótese é que a correlação entre virulência e transmissão no nosso sistema não revele um trade-off. De modo a testar o efeito de diferentes backgrounds genéticos do hospedeiro nas características de uma infeção, recorremos às linhas DGRP (Drosophila Genetic Reference Panel). A população DGRP consiste em mais de 200 linhas inbred (com reduzida diversidade genética) derivadas de uma população natural (Raleigh, USA). Este painel permite o estudo do background genético para determinado fenótipo. Devido a todas as linhas estarem sequenciadas, este painel consiste numa livraria viva de polimorfismos, o que permite a realização de Genome Wide Association Studies (GWAS), de modo a identificar as bases genéticas de fenótipos observados. Utilizando as populações DGRP como dadores de bactéria para uma segunda população, medimos virulência em 92 linhas do painel. Obtivemos percentagens de mortalidade ao longo de todo o espectro (2,1-98%). Confirmámos, que há influência da genética do hospedeiro na suscetibilidade a infeção. Para o fenótipo de transmissão, devido a constrangimentos temporais, apenas 7 linhas foram medidas em. Obtivemos medições de virulência e transmissão ao longo de ambos os espectros (2,1-87% e 3-87,5%). Apesar do reduzido número de pontos, observa-se uma correlação positiva entre as duas características. No entanto, este resultado tem de ser visto com cuidado devido ao reduzido número de pontos obtidos para caracterizar a correlação entre as características. Utilizando os dados fenotípicos, realizámos o GWAS para o fenótipo de virulência. Obtiveram-se cerca de 26 SNPs significativos. No entanto, a maioria dos resultados centra-se em genes com função desconhecida e os restantes, não aparentam qualquer relação com imunologia ou alterações no sistema digestivo. A única exceção é o gene hs6t que está relacionado com o desenvolvimento da traqueia. Os principais resultados deste estudo têm de ser vistos com cuidado devido ao reduzido número de pontos utilizados para construir as duas correlações entre características. No que refere às curvas de correlação entre características, observa-se uma correlação positiva em ambas populações testadas. A falta de mais dados, quer de maior virulência, na população outbred, quer de um maior número de linhas testadas, no estudo usando DGRPs, pode ser apontada como a principal causa de ausência de curva de saturação. Uma outra causa para a ausência de uma curva no nosso sistema, pode dever-se a que o nosso sistema parasita-hospedeiro, seja caracterizado por um outro modelo que não uma curva trade-off. No que se refere aos estudos de bases genéticas, não se observaram resultados expectáveis. A ausência de resultados concludentes pode dever-se ao novo protocolo ou ao reduzido número de linhas testado. No entanto, este projeto permitiu o estabelecimento de um novo protocolo que permite a medição de transmissão utilizando o organismo modelo D. melanogaster, embora ainda precise de ser otimizado, constituindo uma ótima ferramenta para ajudar a compreender melhor a relação complexa que se estabelece entre hospedeiro e parasita num sistema controlado.
Parasitism is seemingly the most common biological interaction that can be established between two organisms. Its importance and interest are not limited to the biological sciences field, but also to agriculture, livestock and human and veterinary medicine. Hence, the study of the interactions between parasites and host is necessary to comprehend and better fight infectious diseases. In these relations, a parasite takes advantage of the host by consuming its resources for its own benefit, such as reproduction and transmission to other hosts. By exploring host resources the parasite causes damage, which is usually called virulence. The trade-off theory states that virulence is an unavoidable consequence of parasite transmission. Hence, a parasite cannot increase its transmission indefinitely because it causes increases damage to the host, which increases the probability of killing the host that compromises transmission. Studies that show this apparently simple constraint are scarce and few have explored the influence of the host genetic background in this model. In this study, we make use of the pathosystem composed by Drosophila melanogaster and its natural pathogen Pseudomonas entomophila, through the natural oral route of infection, to test for a trade-off between these traits during infection. Moreover, we aimed to study how different host genetic backgrounds influence each trait and identify its putatively causative genes. First, we established a protocol to accurately measure virulence and transmission in this system using an D. melanogaster outbred population. We verify a positive correlation between virulence and transmission. Second, we apply this protocol to different host genetic background. As in the outbred population, we find a positive correlation between traits. Moreover, we see that the host genetic background greatly influences the infection traits. However, our data do not fully corroborate the occurrence of a trade-off. Additionally, we study the genetic bases that underlie the different susceptibilities to infection. Surprisingly, our results do not evidence any candidate gene related with immunity or gut development. Our results are still inconclusive and a complete dataset is required to fully address the questions we started off with. However, with this work, we have established an experimental system for the study of the correlation between virulence and transmission between D. melanogaster and P. entomophila. Moreover, our preliminary data showed that even in laboratory established systems there is still much to discover. Expectantly, future studies will address and answer questions that are in the basis of this project and that emerged from obtained results.
Drosophila melanogaster
