Modulation of oxidative stress by superoxide dismutase mimetics

• Author(s): Fernandes, Ana S
• Date: 2010
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/3061
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Tese de doutoramento - 2010
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Oliveira, Nuno Guerreiro de, 1970-; Costa, Judite da Conceição Nunes, 1960-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de doutoramento, Farmácia (Toxicologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2010

Superoxide anion, along with other reactive species, is involved in many toxicological processes, as well as in a number of pathophysiological phenomena. Superoxide dismutase mimetics (SODm), i.e., synthetic compounds that mimic the functional properties of superoxide dismutase converting O2 •– to H2O2 and O2, have thus emerged as prospective pharmaceutical candidates to overcome toxicity in oxidative stress-related conditions. Several metal-containing compounds were previously shown to possess SOD-like activity. This thesis is focused on two promising classes of macrocyclic complexes: manganese(III) porphyrins (MnPs) and macrocyclic copper(II) complexes. The effects of MnTM-4-PyP, a para-substituted MnP, against the cell injury induced by three different oxidants were evaluated in V79 cells. This MnP protected against the cytotoxicity and increase in intracellular O2 •– levels induced by the xanthinexanthine oxidase system (XXO; an extracellular O2 •– generator) and by tertbutylhydroperoxide (TBHP; an analogue of lipid hydroperoxides). However, MnTM-4- PyP did not show considerable protection against the anticancer drug doxorubicin (Dox) that, among other mechanisms of cytotoxicity, generates O2 •– intracellularly. The effects of MnTM-4-PyP were not observed at the cell division level, as shown by the mitotic index analysis. The results of this well established SODm in XXO- and TBHP-treated cells permitted the validation of cell-based models of oxidative stress to be used in the evaluation of the macrocyclic copper(II) complexes developed within the scope of this thesis. Two optimized ortho-substituted MnPs, MnTE-2-PyP and MnTnHex-2-PyP, were also studied in this thesis and their role against TBHP-induced cell injury was evaluated. The two MnPs, even at low concentrations, counteracted remarkably the effects of TBHP in cell viability and intracellular O2 •– levels. While the exposure of V79 cells to TBHP resulted in a significant depletion of total and reduced glutathione and in an increase in GSSG, MnPs augmented markedly the total and reduced glutathione contents in TBHP-treated cells. Two sets of macrocyclic copper(II) complexes, without (CuL1-CuL5) or with a pyridine ring in the macrocyclic backbone (CuL6-CuL9), were synthesized and viii evaluated in vitro for their O2 •– scavenging ability. The complexes were chemically characterized in order to correlate their biochemical activity with thermodynamic, structural and electrochemical features. The complexes CuL3, CuL4 and CuL8 were selected to be further evaluated in cell-based assays since they presented high thermodynamic stability and effective ability to scavenge O2 •–, and were devoid of significant cytotoxicity. These complexes did not show considerable antioxidant activities in the oxidative stress models previously validated (XXO and TBHP). CuL3, CuL4 and CuL8 were also studied as redox modulators of anticancer drugs. The three complexes were shown to undergo Fenton chemistry in vitro. However, CuL3 and CuL4 did not potentiate the cytotoxicity of Dox in breast carcinoma (MCF7) cells. Conversely, CuL8 was shown to improve the therapeutic window of Dox, and especially of oxaliplatin, by both protecting non-tumoral human mammary cells (MCF10A) and boosting the cytotoxic effects in breast carcinoma cells. The results presented in this thesis contribute to the comprehension of SODm as promising pharmaceutical agents both for antioxidant and cancer therapies, reinforcing the high therapeutic potential of this type of compounds.

A produção de espécies reactivas, nomeadamente de O2 •–, está associada a diversos fenómenos toxicológicos e fisiopatológicos. Entre estes, destacam-se os processos de lesão tecidular e inflamação, os quais são factores etiológicos chave num grande número de patologias, incluindo isquémia-reperfusão, aterosclerose, cancro, lesão por radiação, doenças neurodegenerativas, doenças inflamatórias pulmonares, intestinais e cardiovasculares, entre outras. A remoção de O2 •– pode ser assim uma via importante para modular um vasto número de fenómenos patológicos. As enzimas superóxido dismutases (SOD), que catalizam a reacção de dismutação do O2 •– em H2O2 e O2, são metaloproteínas com um papel fulcral na defesa contra o excesso de espécies reactivas. Estudos pré-clínicos e clínicos com SOD têm demonstrado protecção contra os efeitos nocivos de várias situações de stress oxidativo. No entanto, a utilização clínica da enzima nativa apresenta diversas limitações. Tendo em conta que a remoção de O2 •– permite minorar fenómenos inflamatórios, e de modo a ultrapassar as limitações do uso da SOD nativa, têm sido desenvolvidos nos últimos anos compostos de baixo peso molecular com a capacidade de mimetizar as propriedades funcionais da SOD. Estes compostos designam-se usualmente por SOD miméticos (SODm). Várias classes de SODm têm sido desenvolvidas, tendo demonstrado efeitos benéficos notáveis em diferentes modelos de stress oxidativo, quer em cultura de células, quer em modelos animais. A maioria destes compostos contém um ião metálico no seu centro activo, habitualmente Mn(III), Mn(II), Cu(II) ou Fe(III), o qual é estabilizado por coordenação com um ligando. A utilização de ligandos macrocíclicos tem revelado vantagens em termos de estabilidade termodinâmica e actividade catalítica. Neste âmbito, a presente tese incide sobre duas classes de complexos macrocíclicos com actividade mimética da SOD: porfirinas de Mn(III) (MnPs) e complexos macrocíclicos de Cu(II). A classe das MnPs contém os SODm mais potentes e estáveis desenvolvidos até ao momento. Apesar de serem amplamente estudados, os efeitos ao nível celular destes compostos ainda não são totalmente conhecidos. A porfirina para-substituída MnTM-4- PyP é um SODm de eficácia bem estabelecida, disponível comercialmente, que tem vindo a ser estudado em vários modelos de situações fisiopatológicas. Os papel deste SODm face à toxicidade induzida por três oxidantes, cujos mecanismos de toxicidade diferem nas espécies reactivas envolvidas e no local de formação destas, foi avaliado em x células V79, uma linha celular de fibroblastos de pulmão de hamster chinês. Os sistemas oxidantes estudados foram: xantina-xantina oxidase (XXO), um gerador extracellular de O2 •–; tert-butilhidroperóxido (TBHP), um análogo de cadeia curta dos hidroperóxidos lipídicos; e o fármaco citotóxico Doxorrubicina (Dox) que, entre outros mecanismos, gera O2 •– intracelularmente. A porfirina MnTM-4-PyP demonstrou efeitos protectores muito significativos face à XXO e ao TBHP, quer em termos de viabilidade celular (avaliada através dos ensaios MTT e Violeta cristal), quer no que respeita aos níveis intracelulares de O2 •– (avaliados por fluorimetria, com a sonda dihidroetídio - DHE). No entanto, a análise do índice mitótico demonstrou que o efeito protector da MnP não foi observado ao nível da divisão celular. Relativamente à Dox, não se verificaram efeitos protectores consideráveis na presença de MnTM-4-PyP. Através dos resultados obtidos para os sistemas TBHP e XXO, estabeleceram-se protocolos para avaliar os possíveis efeitos antioxidantes dos complexos macrocíclicos de cobre(II) desenvolvidos no âmbito desta tese. Estudos de relação estrutura-actividade anteriormente realizados na Duke University deram origem aos compostos MnTE-2-PyP e MnTnHex-2-PyP, duas MnPs optimizadas substituídas na posição orto, que apresentam uma elevada actividade catalítica. O efeito destas MnPs em células V79 expostas a TBHP foi avaliado. Ambas as MnPs, mesmo em concentrações muito baixas, revelaram uma capacidade notável para reverter o decréscimo de viabilidade celular induzido por este oxidante. Em relação aos níveis intracelulares de O2 •–, o efeito protector das MnPs foi também muito significativo. Foram ainda estudados os efeitos destas MnPs ao nível do glutationo. Em células expostas a TBHP observou-se uma depleção acentuada de glutationo total (quantificado pelo ensaio DTNB) e reduzido (avaliada por fluorimetria, usando a sonda monoclorobimano). Observou-se ainda um aumento considerável da proporção de glutationo na forma oxidada (pelo método DTNB). Em culturas simultaneamente tratadas com TBHP e MnTE-2-PyP ou MnTnHex-2-PyP, registou-se um aumento muito significativo nos níveis de glutationo total, assim como da forma reduzida, restabelecendo-se o equilíbrio do estado redox das células. A segunda parte da presente tese é dedicada ao desenvolvimento e estudo de complexos macrocíclicos de cobre(II) com actividade mimética da SOD. Apesar de terem sido já estudados muitos complexos de Cu(II) para este fim, a descoberta de xi novos complexos com elevada estabilidade e actividade, juntamente com baixa toxicidade constitui ainda um desafio. Foram assim sintetizados dois tipos de complexos macrocíclicos de cobre(II), contendo ou não um grupo piridínico no anel macrocíclico. Para o primeiro grupo de complexos (CuL1-CuL5), os respectivos ligandos foram sintetizados pelo método de Richman e Atkins, seguido da remoção dos grupos protectores por cisão reductiva. No caso do segundo tipo de complexos (CuL6- CuL9), contendo um grupo piridínico no anel macrocíclico, recorreu-se a um processo de ciclização assistida por ião metálico para a obtenção dos ligandos. Os ligandos sintetizados foram caracterizados por ressonância magnética nuclear (1H-RMN e 13CRMN). A estabilidade termodinâmica dos respectivos complexos de cobre(II) foi avaliada por técnicas potenciométricas. Foram ainda realizados estudos estruturais (ressonância paramagnética electrónica e absorção na região do visível) e electroquímicos (por voltametria cíclica), com o objectivo de correlacionar as propriedades químicas dos complexos com a respectiva capacidade de degradar O2 •–. A avaliação desta actividade sequestradora de O2 •– dos complexos foi realizada in vitro, por dois métodos diferentes: a redução do NBT e a oxidação do DHE. Com base nestes estudos seleccionaram-se os complexos com elevada estabilidade termodinâmica, actividade sequestradora de O2 •– efectiva e baixa citotoxicidade, para serem estudados mais aprofundadamente em ensaios celulares. As capacidades antioxidantes dos complexos CuL4, CuL5 e CuL8, foram então avaliadas nos dois modelos de stress oxidativo previamente validados (XXO e TBHP). No entanto, não se observaram efeitos protectores consideráveis face a estes sistemas oxidantes. Os compostos com actividade mimética da SOD têm-se também revelado promissores adjuvantes em quimio- e radioterapia, quer por poderem potenciar a acção antitumoral destes regimes, quer pela possibilidade de protegerem o tecido não tumoral dos seus efeitos adversos. Assim, foram realizados estudos no sentido de avaliar uma possível utilização dos complexos CuL3, CuL4 e CuL8 no contexto do cancro da mama. Muitos dos complexos de cobre(II), para além de dismutarem o O2 •–, podem reagir com o H2O2 formado produzindo HO•, o que poderá ter vantagens na supressão da proliferação de células tumorais. Os três complexos foram assim avaliados pelo ensaio de clivagem do DNA plasmídico, tendo demonstrado capacidade de gerar HO•. No entanto, os complexos CuL3 e CuL4 não potenciaram a citotoxicidade da Dox em células humanas de carcinoma da mama (MCF7). Por outro lado, o complexo CuL8 xii revelou a capacidade de modulação redox dos efeitos da Dox e, sobretudo da oxaliplatina, em células mamárias humanas. Este complexo exerceu um efeito citoprotector em células mamárias não tumorais (MCF10A) e potenciou o efeitos dos fármacos citotóxicos nas células tumorais MCF7. O complexo CuL8, ao melhorar a janela terapêutica dos fármacos antitumorais Dox e oxaliplatina, poderá ser útil como adjuvante em regimes quimioterápicos e deverá ser mais estudado neste sentido. Em suma, o desenvolvimento de SODm é uma área em grande expansão, dadas as múltiplas oportunidades terapêuticas destes compostos. Os resultados descritos na presente tese contribuem para um conhecimento mais aprofundados dos efeitos dos SODm quer em terapêutica antioxidante, quer em terapêutica antitumoral, reforçando o elevado potencial farmacoterapêutico destes compostos

Fundação para a Ciência e a Tecnologia: Project POCTI/49114/QUI/2002 and PhD fellowship (SFRH/BD/28773/2006).