Biosensor evaluation of the antioxidant activity of wines and teas. Interference studies and comparison with other

• Author(s): Gil, Dulce Martins de Albuquerque, 1969-
• Date: 2011
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/3800
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Biossensores; Polifenois; Antioxidantes; Vinhos; Chá
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Rebelo, Maria José Ferreira, 1948-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de doutoramento, Bioquímica (Biotecnologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011

Polyphenolic compounds are a complex group of substances commonly found in fruit, vegetables and their products, which have gained enormous relevance in the analytical chemistry field in the recent years, largely due to the concomitant health benefits associated with their antioxidant activity. Therefore, it is of great interest to evaluate the antioxidant activity of natural foodstuff and beverage related to its polyphenolic content. Thus, there is an increase demand for highly sensitive and selective analytical method for the determination of phenolics. Biosensors offer advantages as alternatives to conventional methods due to their inherent specificity, simplicity and quick response. An amperometric biosensor based on laccase, from Tramates versicolor (TvLac) developed by our group was used to determine the total polyphenolic content in wine and green tea/herbal infusions samples. The purpose of this work comprised the assessment of the antioxidant activity of those samples in relation to their polyphenolic content using a laccase based biosensor. Interference studies on polyphenolic amperometric biosensing were performed for metabissulfite and gallic acid (GA). In order to investigate these subjects, the following analytical methods were performed: Determination of bioelectrochemical polyphenolic index (BPI) using the laccase-based biosensor; Determination of total phenolic content (TPC) using Folin–Ciocalteu method; Determination of total antioxidant activity (TAA) using ABTS assay; Cyclic voltammetry; HPLC – DAD analysis; Spectroscopic and TvLac activity/inhibition assays. The results obtained showed that the linear relationship between total antioxidant activity and bioelectrochemical polyphenol index determined by our laccase biosensor enabled the calculation of the TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) of a wine and tea, the most widely consumed beverages worldwide, from its bioelectrochemical polyphenol index. It was found that immobilised laccase was less inhibited by metabissulfite than free laccase. A confirmation of the influence of metabisulfite on Folin-Ciocalteu measurements was also undertaken. The results have indicated that GA presents an inhibitory behaviour on TvLac activity in a concentration-dependent manner. The GA’ interference on polyphenolic amperometric biosensing is the result of the combination of two factors: on one hand, we have the inhibitory enzymatic effect, and on the other, the reaction of GA’ oxidation products with the o-quinones obtained by the enzymatic oxidation of caffeic acid. Both gave rise to the amperometric signal decreasing effect. The very strong correlation (r2 equaled 0.9949) between BPI/TPC obtained for herbal infusions, allowed us to conclude that the laccase-based biosensor, used in this research, provided a valuable tool to obtain a valid estimation of the classical Folin-Ciocalteu index, in an uncomplicated and fast way.

Os polifenóis constituem um complexo grupo de substâncias comummente encontradas em frutas, vegetais e seus produtos. A importância da pesquisa de compostos fenólicos em alimentos/bebidas deve-se ao facto de muitos destes compostos apresentarem propriedades antioxidantes. A acção dos antioxidantes no combate ao stress oxidativo tem sido objecto de estudo em diversos trabalhos que demonstram a importância destes compostos na prevenção de doenças associadas ao envelhecimento, diminuindo o risco de doenças cardiovasculares e o aparecimento de cancro. A actividade antioxidante dos compostos fenólicos depende basicamente de algumas das suas propriedades intrínsecas, tais como, o potencial de redução, a capacidase de quelar metais, e da possibilidade de captar/sequestrar radicais livres. É de grande interesse avaliar a actividade antioxidante de alimentos naturais e de bebidas relacionada a seus constituintes polifenólicos. Para esse efeito, uma série de diferentes métodos analíticos encontram-se disponíveis, tais como GC, HPLC e métodos espectrofotométricos. No entanto, estas técnicas são dispendiosas, consomem reagentes e tempo. O método de Folin-Ciocalteu é uma das abordagens mais utilizadas para a determinação espectrofotométrica do conteúdo total de compostos fenólicos em alimentos. No entanto, este método produz uma sobreestimativa do teor de polifenóis totais (TPC), devido à sua baixa especificidade, uma vez que o reagente Folin-Ciocalteau reage com outras substâncias redutoras não fenólicas presentes na amostra. Consequentemente, verifica-se um aumento na procura de métodos analíticos mais sensíveis e selectivos para a determinação de compostos fenólicos. Assim sendo, os biossensores oferecem grandes vantagens como alternativa aos métodos convencionais devido a serem simples, sensíveis, confiáveis e de resposta rápida, necessitando de instrumentação de baixo custo, operam em condições em que não é necessário um pré-tratamento da amostra, e permitem efectuar determinações numa ampla faixa de concentração. Um biossensor pode ser definido como um sensor que combina a actividade selectiva de um elemento biológico sensível ao analito de interesse, ligado a um transdutor que converte o sinal biológico em um sinal eléctrico proporcional à concentração do analito. Os biossensores eletroquímicos podem ser divididos em: amperométricos, potenciométricos e condutimétricos. O princípio de funcionamento dos biossensores amperométricos é caracterizado pela medida da corrente produzida por uma reacção química entre espécies electroactivas. Esta reacção ocorre num potencial determinado, e a corrente gerada está relacionada com a espécie em solução. Assim estes biossensores dependem tipicamente de um sistema biológico que converta cataliticamente analitos inactivos electroquimicamente em produtos que possam ser oxidados ou reduzidos num eléctrodo de trabalho, o qual é mantido a um determinado potencial vs um eléctrodo de referência. A corrente produzida pela reacção redox é linearmente proporcional à concentração do produto eletroactivo, a qual é proporcional ao analito (substrato da enzima) não eletroactivo. Na realização do trabalho experimental foi empregue um biossensor amperométrico baseado no enzima lacase de Trametes Versicolor (EC. 1.10.3.2) (TvLac) imobilizado numa membrana de polietersulfona. Lacase é um oxidase com múltiplos centros de cobre que catalisam a oxidação de vários compostos aromáticos como é o caso dos polifenóis, a quinonas e/ou a espécies radicalares. Nesta reacção, o oxigénio é reduzido directamente a água, sem a formação de peróxido de hidrogénio. Então, no sistema biossensor, a lacase catalisa a oxidação de polifenóis às o-quinonas correspondentes, que são reduzidas ao polifenol inicial, no eléctrodo. A corrente resultante é utilizada como resposta analítica. O trabalho experimental realizado nesta tese objectivou-se na avaliação de actividade antioxidante de vinhos Portugueses (branco, rosé e tinto) e de chás/infusões de ervas, em relação ao seu conteúdo fenólico total usando o biossensor à base de lacase. O estudo de interferências no desempenho do biossensor foi realizado para o metabissulfito e para o ácido gálico (GA). A investigação dos referidos objectivos envolveu fundamentalmente a realização dos seguintes métodos analíticos: Determinação do índice bioelectroquímico polifenólico (BPI) ,em equivalentes de ácido caféico, usando o biossensor baseado em lacase; Determinação do conteúdo total polifenólico (TPC), usando o método de Folin- Ciocalteu; Determinação da actividade antioxidante total (TAA), usando o método de ABTS ou TEAC (trolox equivalent antioxidant activity); Voltametria cíclica; Análises por HPLC-DAD; Determinação de actividade/inibição enzimática de TvLac. Os resultados obtidos nos estudos desenvolvidos mostraram que: Foi observada uma boa correlação entre as propriedades antioxidantes (TAA) dos vinhos estudados (9 tintos, 5 brancos e 3 vinhos rosés), determinado pelo ensaio ABTS e o BPI em pH 3,5, com o biossensor, tomando ácido caféico como a solução de referência. A relação linear entre TAA e BPI permitiu o cálculo da actividade antioxidante de vinhos tintos, rosé e branco, a partir do seu conteúdo em equivalentes de ácido caféico, avaliado pelo biossensor . A metodologia empregue no biosensor baseado em lacase apresenta vantagens em relação a outras. Na verdade o bioeléctrodo é muito simples de preparar, com uma rápida imobilização do enzima na membrana polietersulfona. Além disso, as medições da solução de referência e da amostra de vinho foram realizadas em pH 3,5, que é um valor próximo do pH médio de vinhos. O metabissulfito constituiu interferência nas medições realizadas com os biossensores à base de TvLac e também influenciou os resultados obtidos pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu. Relativamente ao GA foi observado um efeito sinergético negativo na resposta do biossensor, a uma mistura de polifenóis contendo o GA. Os resultados indicaram que o GA apresenta comportamento inibitório sobre a actividade do TvLac, dependente da concentração. De facto, os resultados apresentados neste trabalho demonstraram que a presença de GA diminui a actividade enzimática do TvLac em solução e imobilizado. Além disso, foi demonstrado que a oxidação de GA e dos produtos subsequentes (oquinonas), interferiram com o ácido caféico (CA) e os produtos da oxidação de CA, contribuindo, deste modo, para a redução efectiva da resposta do biosssensor, devido ao desaparecimento dos produtos finais enzimaticamente oxidados. A correlação muito forte (r2 = 0,9949) entre o BPI / TPC obtida para infusões de ervas permitiu concluir que o biossensor, utilizado neste trabalho, apresenta-se como uma útil ferramenta analítica para obtenção de uma estimativa válida do clássico índice de Folin-Ciocalteu, de uma forma simples e rápida. Assim sendo, recomenda-se de que os resultados obtidos com os biossensores à base de lacase e com o método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu devem ser relatados como "equivalente de ácido caféico". Trabalho futuro deverá ser realizado a fim de quantificar e/ou evitar o efeito das substâncias interferentes referidas.

Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT, SFRH/BD/34511/2006); Lisbon University’ Chemical/Biochemical Department; Research & Development Department at SOGRAPE VINHOS S.A.