Author(s): MANAGEIRO, VERA
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/4313
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Bactérias gram-negativas; Resistência antimicrobiana; Beta-lactamases; Epidemiologia molecular; Dinâmica molecular; Teses de doutoramento - 2011
Tese de doutoramento, Biologia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
β-Lactamase production is the most important resistance mechanism among Gram-negative bacteria. The overall aim of this PhD thesis was to contribute to the knowledge of molecular epidemiology of β-lactamases and to the understanding of their diversity in a structural-functional level. To accomplish this aim, several studies with different approaches were performed. The emergence of β-lactamase-producing isolates, as well as the appearance of new epidemic clones, is of great concern. The studies presented in the first chapter of results, have clearly shown that specific extended-spectrum β-lactamase (ESBL) -, plasmid-mediated AmpC β-lactamase (PMAβ)- and carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase (CHDL)-producing clones are able to persist in clinical settings for long periods, resulting in a complex β-lactamase endemic situation. A high diversity of β-lactamases was encountered, specifically: CTX-M family which is the most prevalent ESBL, and PMAβ (e.g., DHA-1, CMY-2, CMY-39, MIR-1, MIR-3, FOX-5 and the novel CMY-46 and CMY-50), both in Enterobacteriaceae, as well as CHDLs OXA-23 and OXA-24/40 in Acinetobacter baumannii. The results obtained in this thesis also highlight different strategies for bacterial spread of resistance that can occur through either clonal spread or horizontal gene transfer of mobile genetic elements. In the second chapter of results, structure/function correlation of five novel clinical important β-lactamases, namely three inhibitor-resistant SHV (SHV-72, SHV-84 and SHV-107), one ESBL (SHV-55) and one parental SHV (SHV-99), are presented. One of the key findings we can infer from results is that the conserved motif Lys234-Thr/Ser235-Gly236, present in class A β-lactamases, is a hot-spot for β-lactamase inhibition, meaning that new compounds can be designed to address this structural feature. In summary, the work performed in this thesis allows the elucidation on the dynamics of β-lactamases in Gram-negative bacteria, in Portugal. Molecular characterization together with biochemical data is essential for understanding the emergence of new resistance mechanisms and their spread.
A introdução de antibióticos β-lactâmicos na prática clínica, nomeadamente de oximino-β-lactâmicos e carbapenemos, em resposta ao aumento da prevalência de bactérias patogénicas produtoras de β-lactamases, tais como E. coli e K. pneumoniae, levou ao aparecimento de uma maior diversidade dessas enzimas, com uma actividade catalítica alargada. Actualmente existem mais de 860 β-lactamases descritas em bactérias clinicamente importantes (http://www.lahey.org/Studies/). O trabalho apresentado nesta tese de doutoramento pretendeu responder a várias questões na área da resistência aos antibióticos, nomeadamente: Quais os actuais mecanismos de resistência aos oximino-β-lactâmicos e aos carbapenemos em isolados de Enterobacteriaceae e Acinetobacter baumannii e se, porventura emergentes, quais os mecanismos implicados na sua disseminação? Se propagados à comunidade, quais os mecanismos subjacentes? Quais os factores de risco associados? Que substituições aminoacídicas são responsáveis por alterações estruturais nas β-lactamases e qual a consequência a nível da actividade hidrolítica? As respostas a estas questões são apresentadas em dois capítulos distintos desta dissertação, correspondendo aos resultados obtidos durante a realização da mesma (Secção II). O Capítulo 1, intitulado "β-lactamases: o impacto na resistência aos antibióticos, disseminação e co-resistência", permitiu avaliar a emergência de isolados produtores de β-lactamases de espectro alargado (ESBL; extended-spectrum β-lactamases) e de -lactamases AmpC plasmídicas (PMAβ, plasmid-mediated AmpC β-lactamases) (Artigo I e II, respectivamente). A disseminação de isolados de A. baumannii multirresistentes foi também identificada e correlacionada com a expressão de β-lactamases de Class D capazes de hidrolisar carbapenemos (CHDL, carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase) (Artigo III). O Capítulo 2 avalia a estrutura e função de cinco novas β-lactamases com importância clínica: três SHV resistentes aos inibidores (IRS, inhibitor-resistant SHV) (SHV-72, SHV-84 e SHV- 107), uma ESBL (SHV-55) e uma SHV parental (SHV-99). Glovalmente, os resultados aqui apresentados contribuíram para o conhecimento da epidemiologia molecular das β-lactamases, assim como para a compreensão da actividade associada à sua estrutura secundária e terciária. O primeiro estudo realizado (Artigo I) teve como principal objectivo avaliar a disseminação e a evolução dos mecanismos de resistência aos antibióticos oximino-β-lactâmicos, de entre os quais se destacam as cefalosporinas de terceira geração, em isolados de Enterobacteriaceae. Para tal, foram estudados 220 isolados, apresentando multirresistência a diferentes desses antibióticos, provenientes de um hospital da área de Lisboa (1999 e 2004-2008). Este estudo documenta a emergência e disseminação de genes blaESBL em Portugal, desde, pelo menos, o ano de 2004. No primeiro período do estudo, todas as β-lactamases detectadas eram não-ESBL, incluindo TEM-1, SHV-1 e enzimas da família CMY-2. Durante o segundo período, houve um aumento significativo ESBLs encontradas (8 em 2004, 58 em 2008), de entre as quais 94,8% eram da família CTX-M, sendo a variante mais prevalente a β-lactamase CTX-M-15 (80,5%). De notar, a presença de um novo clone epidémico local, transitório, de K. pneumoniae, produtor de CTX-M-3, associado a um aumento da frequência de ESBL da família CTX-M. Esta foi a primeira descrição de estirpes produtoras de CTX-M-3 em Portugal, a qual foi inicialmente reportada em 1995, na Polónia, em isolados de Citrobacter freundii e Escherichia coli. Para este hospital, foram identificados como factores de risco associados à resistência ao antibióticos oximino-β-lactâmicos, a idade superior a 65 anos, infecções nosocomiais e produção de β-lactamases da família CTX-M. A resistência aos antibióticos oximino-β-lactâmicos no Artigo I, não foi, no entanto, atribuída apenas à produção de ESBLs. No decorrer do estudo foram detectadas não só β-lactamases não-ESBLs da família TEM e SHV, mas também PMAβs, nomeadamente CMY-2. Em Portugal, à data de início da presente tese, pouco se conhecia acerca da existência e disseminação de PMAβ, quer em meio hospital, quer na comunidade. Assim, no Artigo II, colmatando a necessidade de conhecimento nesta matéria, foi pesquisada a eventual produção de PMAβ em isolados de Enterobacteriaceae, nos quais não existe expressão de ampC cromossómica, nomeadamente, E. coli, Klebsiella spp. e Proteus mirabilis. Neste estudo, identificou-se uma prevalência de 2,8% de isolados produtores de PMAβ num total de 2570 isolados clínicos, obtidos em 28 hospitais portugueses, em diferentes períodos (1999 e 2004-2009). Entre os isolados produtores de PMAβ, 9.9% foram identificados em 1999 e 90,1% no segundo período. Globalmente, foi encontrada uma importante diversidade de β-lactamases, destacando-se não só PMAβs (DHA-1, CMY-2, CMY-39, MIR-1, MIR-3, FOX-5 e as novas CMY-46 e CMY-50), como também ESBLs da família CTX-M, e enzimas da família SHV e TEM. Foi também pesquisada a ocorrência de determinantes plasmídicos de resistência às quinolonas (PMQR, plasmid-mediated quinolone resistance), assim como a sua associação com ESBLs e PMAβs, o que era desconhecido até então. Os resultados obtidos demonstraram uma co-expressão de PMAβs com ESBLs (50,7%) e com PMQRs (78,9%), respectivamente. No decorrer deste estudo foi detectada a presença de QnrC em dois isolados, os quais representam a segunda descrição deste determinante PMQR, para além da primeira publicada na China, em 2009. A elevada disseminação de enzimas PMAβ poderá estar associada à transferência horizontal dos respectivos genes codificantes, através de plasmídeos e/ou de elementos móveis, como ISEcp1, IS26 e IS903, encontrados com uma frequência de 23,5%, 17,6% e 46,0%, respectivamente. Acresce o facto de 91.5% dos isolados produtores de PMAβ do estudo possuírem o gene intl1, o que indica a presença de integrões de classe 1, e realça o papel importante que os elementos genéticos móveis têm na disseminação da resistência. O estudo da clonalidade, realizada por electroforese em campo pulsado (PFGE), evidenciou heterogeneidade genética dos clones produtores de PMAβs, embora tenham sido identificados clones epidémicos locais, particularmente produtores de β-lactamases da família DHA. Em relação aos clones produtores de CMY, 66,7% não eram geneticamente relacionados, apesar de distribuídos por diferentes serviços hospitalares e pela comunidade. O uso excessivo de antibióticos no tratamento de infecções bacterianas, nomeadamente de carbapenemos, tem contribuído para a emergência de β-lactamases capazes de hidrolisar esses antibióticos. A expressão de CHDLs em A. baumannii quer de origem cromossómica, através de uma sobre-expressão do gene blaOXA-51-tipo, quer através da aquisição de plasmídeos que codificam, por exemplo, genes da família blaOXA-23 e/ou blaOXA-24/40, é preocupante. Em Portugal, a resistência aos carbapenemos em isolados de A. baumannii tem sido associada à produção de OXA-24 (ou OXA-40), e atribuída à disseminação de um clone endémico, multirresistente. Para conhecimento da situação actual, em Portugal, foram avaliados 172 isolados provenientes de nove hospitais portugueses, de Abril de 2009 a Abril de 2010 (Artigo III). Os resultados obtidos demonstram uma alteração na epidemiologia molecular dos isolados de A. baumannii no país. Assim, os clones ST98, produtores de OXA-24/40, e ST92, produtores de OXA-23, os quais coexistiam numa situação endémica antes de 2009, verificou-se terem sido substituídos pelo clone ST118, produtor de OXA-23, identificado em todo o mundo como responsável por epidemias de isolados clínicos de A. baumannii multirresistentes. Em suma, os resultados obtidos no capítulo 1 contribuíram para o conhecimento da epidemiologia molecular de diferentes β-lactamases, realçando clones específicos de Enterobacteriaceae, produtores de ESBL e/ou PMAβ, e de A. baumannii, produtores de CHDLs, com capacidade de persistir e disseminar em ambiente hospitalar e na comunidade, dando origem a uma situação endémica complexa. No Capítulo 2, intitulado "Classe A β-lactamases: função vs estrutura", é descrita a relação estrutura-função de β-lactamases com importância clinica, levando a um maior conhecimento da proteína, enquanto mecanismo de resistência. No decorrer da caracterização genotípica, foram detectados genes que codificam novas enzimas, algumas das quais envolvidas na resistência a cefalosporinas de terceira geração (ESBL) ou a inibidores de β-lactamases (IRS, Inhibitor Resistant SHV). A caracterização bioquímica de cinco novas β-lactamases permitiu compreender a sua actividade catalítica sobre os diferentes substratos, os antibióticos β-lactâmicos. Numa primeira fase, foi efectuada a caracterização bioquímica de três novas β-lactamases (SHV-72, SHV-84 e SHV-107) expressando um aumento da resistência à combinação amoxicilina/ácido clavulânico (Paper IV ao VI). No total, com a identificação destas três novas enzimas, o número de β-lactamases da família SHV que conferem resistência aos inibidores (IRS) aumentou para sete (http//www.lahey.org/studies/webt.asp). Na β-lactamase SHV-72 identificaram-se as substituições aminoacídicas Ile8Phe, Ala146Val e Lys234Arg. As constantes cinéticas mostraram um aumento na concentração de ácido clavulânico para a inibição de 50% da actividade enzimática (em relação à parental SHV-1). De referir que as mutações observadas na β-lactamase SHV-72 não alteraram significativamente os valores de afinidade (Km) e não conferiram uma diminuição da actividade catalítica (Kcat) para as penicilinas, como reportado para as outras IRS descritas, nomeadamente SHV-84 (Paper V) e SHV-59 (nas quais a substituição Lys234Arg é única ou associada a Leu35Gln, respectivamente). Assim, este estudo sugere que outras substituições aminoacídicas na β-lactamase SHV-72, que não Lys234Arg, conferem um aumento da afinidade da enzima para as penicilinas, assim como uma maior actividade catalítica. Simulações, efectuadas por dinâmica molecular, sugeriram que a substituição aminoacídica Lys234Arg, presente em SHV-72, era responsável pela estabilização da conformação da cadeia lateral de Ser130, impedindo a sua ligação com Ser70, o que poderá diminuir a susceptibilidade ao ácido clavulânico. As propriedades catalíticas da enzima SHV-107, uma IRS apresentando as substituições aminoacídicas Leu35Gln e Thr235Ala, demonstraram que esta mutação não confere alterações significativas na resistência às penicilinas, apesar de a actividade catalítica ser inferior em SHV-1. Simulações, efectuadas por dinâmica molecular, para a substituição aminoacídica Thr235Ala, sugeriram que esta modifica a acomodação do ácido clavulânico no sítio activo da enzima e, consequentemente, altera a sua função de inibição. Em conclusão, os resultados obtidos no estudo bioquímico do mecanismo de resistência ao ácido clavulânico, permite-nos inferir que o motivo Lys234-Ser/Thr235-Gly236, conservado em β-lactamases de classe A, é um ponto essencial para a inibição das β-lactamases, o que significa que novos inibidores poderão ser desenhados, tendo em consideração as características estruturais e funcionais da β-lactamase nesse motivo. As propriedades enzimáticas da nova β-lactamase SHV-55 (com as mutações Tyr73Phe, Gly238Ser e Glu240Lys) evidenciaram a sua maior afinidade para as cefalosporinas de espectro alargado, característica das ESBLs, em contraste com a enzima parental SHV-1. Por outro lado, a β-lactamase SHV-99, que apresentava a substituição aminoacídica Asp104Gly, evidenciou um aumento na afinidade para o aztreonam, sugerindo que este resíduo é importante para a ligação e reconhecimento da enzima ao substrato. Assim, mesmo não conferindo um fenótipo ESBL, este estudo mostra a importância da caracterização de novas β-lactamases, uma vez que, sob pressão de selecção, a evolução das ESBL e IRS terá o seu início nas β-lactamases parentais. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta dissertação, permite a elucidação da dinâmica das β-lactamases produzidas por bactérias de Gram negativo, em Portugal. A ocorrência de Enterobacteriaceae produtoras de ESBL, assim como a disseminação de novos clones epidémicos, nomeadamente de A. baumannii multi- ou pan-resistentes, é de grande preocupação. De facto, os resultados apresentados reforçam a necessidade de desenvolver estratégias de intervenção, no sentido, quer de prevenir o desenvolvimento de bactérias resistentes aos antibióticos, quer de reduzir a sua disseminação nos hospitais e destes para a comunidade.
Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, (SFRH/BD/32578/2006)
