Author(s): Almeida, Francisca Monjardino Ferreira de
Date: 2010
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/5714
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Ácido retinóico; Placas de Peyer; Sinalização por RET; Órgãos linfóides secundários; Organogénese; Teses de mestrado - 2010
Tese de mestrado, Bioquímica , Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
O desenvolvimento embrionário é um período crítico da vida do indivíduo durante o qual são formados os sistemas biológicos essenciais à sua sobrevivência. Exemplo disso é o sistema linfóide dos mamíferos, sistema este que consiste numa rede de órgãos linfóides que são classificados em primários ou secundários. É de notar que ao longo da vida adulta outras estruturas linfóides denominadas “terciárias” podem ser formadas, o que acontece no caso de certas inflamações crónicas ou infecções persistentes. Enquanto os órgãos linfóides primários, tais como a medula óssea e o timo, são locais privilegiados onde ocorre o desenvolvimento das células hematopoiéticas; os órgãos linfóides secundários formam uma rede ao longo do corpo onde residem linhas celulares hematopoiéticas maduras. Os órgãos linfóides secundários incluem, entre outros, os nódulos linfáticos e as placas de Peyer. Estas estruturas são cruciais na iniciação de respostas imunes uma vez que providenciam as condições ideais que levam à activação, diferenciação e homeostasia dos linfócitos. Para o correcto desenvolvimento destes órgãos é necessária a expressão de diversos genes bem como a interacção entre diferentes tipos celulares. Durante o desenvolvimento dos nódulos linfáticos é necessária a interacção de células hematopoiéticas denominadas células indutoras do Tecido Linfóide (LTi) e de células mesenquimais designadas células organizadoras do Tecido Linfóide (LTo). Esta interacção celular conduz à maturação das células mesenquimais ou de estroma que por sua vez resulta na atracção de células LTi adicionais. Este “feedback” positivo resulta na formação do primórdio do nódulo linfático. O desenvolvimento das Placas de Peyer (PP) está bem caracterizado e, à semelhança dos nódulos linfáticos, requer interacções entre células hematopoiéticas e de estroma. No entanto, para além das células LTi e LTo, um outro tipo de células hematopoiéticas, denominado células iniciadoras do Tecido Linfóide (LTin) estão envolvidas neste tipo de interacções. O modelo correntemente proposto para o desenvolvimento das PP postula que as células LTin interagem inicialmente com as células LTo através do eixo de sinalização RET/ARTN. Este sinal inicial resultaria então na maturação inicial das células do estroma e consequente produção de quimiocinas que, por sua vez, atrairiam células LTi formando-se assim o cluster celular que está na origem do primórdio do órgão. Apesar dos paralelos existentes entre o desenvolvimento dos nódulos linfáticos e das PP, estas estruturas não utilizam exactamente os mesmos eixos de sinalização. No caso dos nódulos linfáticos as mais importantes vias de sinalização são TRANCE e Linfotoxina β (LTβ). Inicialmente a interacção entre os dois tipos celulares é feita através da expressão de TRANCE pelas células de estroma e do seu receptor pelas células LTi. Aquando desta interacção, ocorre a indução da expressão de LTαβ na superfície das células LTi. Por sua vez as células LTo são activadas através do receptor de LTβ expresso na superfície destas últimas. Esta activação induz a produção das quimiocinas CXCL12 e CXCL13 atraindo assim células LTi adicionais. No caso das placas de Peyer as vias de sinalização mais importantes são RET, IL-7R e LTβ. Pensa-se que é através da via de sinalização RET que ocorre a expressão de LTβ nas LTin, expressão esta que permite que ocorra a sua interacção com as células de estroma. À semelhança do que acontece nos nódulos linfáticos, esta interacção de ligando/receptor irá originar um “feedback” positivo, atraindo assim as células LTi para o local do cluster. Estas células por sua vez, através da sinalização dada pelo IL-7R, irão expressar LTβ como as células LTin e interagir finalmente com as células LTo. A análise de animais deficientes em certas vias de sinalização reforça também a ideia que o desenvolvimento dos nódulos linfáticos e das placas de Peyer não obedece exactamente aos mesmos princípios. A título de exemplo, ratinhos deficientes em TRANCE não possuem nódulos linfáticos uma vez que a maturação das células de estroma é deficiente, no entanto possuem placas de Peyer normais. Por outro lado, deficiências no receptor da quimiocina IL7 resultam no desenvolvimento de apenas alguns nódulos linfáticos, demonstrado que esta via é importante, mas não crucial, para o desenvolvimento destas estruturas linfáticas. Contudo, estes animais são totalmente desprovidos de placas de Peyer, provando que esta via é essencial para o desenvolvimento deste tipo de estruturas entéricas. É ainda de notar que a via de sinalização RET é apenas essencial para o desenvolvimento de placas de Peyer . Ratinhos deficientes nesta tirosina quinase apesar de desenvolverem nódulos linfáticos são totalmente desprovidos de placas de Peyer. O processo de desenvolvimento embrionário requer no sentido mais lato várias vias de sinalização, sendo exemplo disso a do ácido retinóico (RA). Recentemente, o ácido retinóico surgiu como uma das moléculas importantes no desenvolvimento dos nódulos linfáticos. Van Pavert et al. descreveram que o RA produzido por células nervosas, adjacentes a células de estroma, induzia nestas últimas a produção da quimiocina CXCL13. Desta forma, esta molécula parece estar envolvida no despoletar de uma retroacção positiva que origina o primórdio dos nódulos linfáticos. Uma vez que o ácido retinóico parece ser importante no desenvolvimento dos nódulos linfáticos, pretendemos determinar se esta via de sinalização é também importante para o desenvolvimento das estruturas linfóides entéricas, nomeadamente das Placas de Peyer. Com este intuito, inicialmente utilizámos ratinhos geneticamente modificados que permitem a visualização, análise e manipulação ex vivo de todas as subpopulações hematopoiéticas durante a organogénese linfóide. A utilização destes modelos permite a micro dissecção de estruturas linfóides secundárias no embrião e a purificação ex vivo de populações hematopoiéticas e mesenquimais genuínas em diferentes estádios de desenvolvimento. Em paralelo, através de estudos imunocitoquímicos e genéticos, verificámos que o intestino embrionário alberga não apenas células que exprimen RALDH1, enzima importante na síntese de RA, bem como células alvo de RA. Tendo em conta estes modelos e os resultados assim obtidos prosseguimos com os objectivos propostos. De modo a compreender a influência do RA na formação das estruturas linfóides entéricas utilizámos culturas de intestinos embrionários nas quais é possível colocar micro-esferas de agarose impregnadas com ácido retinóico. Neste sistema observámos que o RA induz a formação de agregados de células hematopoiéticas que por sua vez induzem a expressão de VCAM-1 em células de estroma, formando assim estruturas linfóides embrionárias atópicas. É de notar que a composição celular dos agregados celulares formados pela sinalização RA é idêntica à composição das estruturas formadas pela sinalização via RET, isto é, células LTi e LTin. Relevante também é a correlação destas duas vias de sinalização, que foi possível estudar com base em culturas de intestinos embrionários onde se bloqueou a via de sinalização do ácido retinóico, fornecendo simultaneamente a sinalização por RET. Este bloqueio diminuiu significativamente a eficiência de agregação celular pela sinalização RET. Por outro lado, na ausência de RET, a eficiência de agregação por RA não foi modificada. Estes resultados sugerem que a via de sinalização por RA actua independentemente de RET e desempenhara a sua função maioritariamente a montante de RET. Adicionalmente verificámos que, o RA não aparenta estar envolvido na motilidade das células hematopoiéticas durante a organogénese entérica linfóide. O ácido retinóico está directamente interligado com a produção de quimiocinas durante o desenvolvimento dos nódulos linfáticos. Uma vez que esta molécula parece ter um papel semelhante no desenvolvimento das PP, é plausível que estas quimiocinas também estejam envolvidas na sinalização de RA durante o desenvolvimento destas estruturas. Com este pressuposto em mente, foram analisadas por reacção quantitativa de polimerase em cadeia (qPCR) amostras celulares de intestino fetal estimuladas com ácido retinóico durante 24h. Esta análise revelou que nem CXCL12 nem CXCL13 estavam sobreexpressas após estimulação. De forma a confirmar este resultado foram feitas culturas de intestinos embrionários onde foi fornecido o sinal de ácido retinóico e bloqueadas as quimiocinas em questão. Os resultados obtidos vieram confirmar a conclusão anterior, demonstrando que CXCL12 e 13 não são importantes para a sinalização de RA no desenvolvimento das placas de Peyer. Contudo, uma vez que outras quimiocinas podem estar envolvidas no desenvolvimento destas estruturas, foram feitos ensaios de expressão genética a partir de amostras celulares entéricas estimuladas com ácido retinóico. Estes estudos revelaram que a via de sinalização pelo ácido retinóico resulta numa assinatura genética que difere da previamente descrita durante o desenvolvimento dos nódulos linfáticos, apontando para um possível papel na diferenciação das células hematopoiéticas. Em conjunto, estes resultados apontam para um papel do ácido retinóico no desenvolvimento das placas de Peyer. O ácido retinóico emerge então como uma nova molécula importante na organogénese destas estruturas.
Secondary Lymphoid Organs (SLOs), such as Lymph Nodes (LN) and Peyer’s Patches (PP), are crucial structures for the initiation of immune responses. Several molecules are required for the development of these structures, namely Lymphotoxin and several chemokines, while the tyrosine kinase RET has been shown to play a key role in PP organogenesis. Retinoic Acid (RA) has recently emerged as an important player during LN development through induction of CXCL13 expression. Despite many similarities, LN and PP development differ in several aspects. Here we show that RA specifically induces clustering of enteric haematopoietic cells, and is sufficient to induce the maturation of sessile mesenchymal cells. Interestingly, both RET and RA induced clusters are similarly composed by LTi and LTin cells. This finding suggested that RA and RET signalling could participate in the same events during PP formation. However, haematopoietic clustering induced by ARTN was only marginally affected by RA signalling block and absence of RET signalling did not impact on RA mediated clustering. Altogether, these results suggest that RA acts independently and mainly precedes RET signals. Furthermore, and contrary to LN development, we show that chemokines such as CXCL12 and 13 are not upregulated in gut samples stimulated with RA, neither affect clustering efficiency by RA. Altogether these results suggest that during PP development RET and RA signals act mostly independently of each other and that enteric RA signalling leads to a genetic signature that differs from what was previously described during LN development. RA emerges as a novel molecule in PP organogenesis. We suggest that this pathway may be involved with other signalling pathways in the processes that underlie enteric lymphoid organ formation and haematopoietic differentiation. These hypotheses will be further discussed taking advantage of both in vitro and in vivo approaches.
