Author(s): Primo, Maria do Nascimento Lopes, 1988-
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/6374
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Psoríase; Sistema imunitário; Doenças auto-imunes; Expressão génica; Teses de mestrado - 2011
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
A psoríase vulgares é uma doença cutânea que ocorre aproximadamente em 3% da popula-ção mundial adulta, afectando negativamente a qualidade de vida dos doentes. É uma doença crónica, resultante da activação do sistema imunitário e semelhante a outras doenças auto-imunes como a artrite reumatóide ou a esclerose múltipla. Histologicamente, a psoríase é caracterizada por um aumento da espessura da epiderme devido à hiperproliferação de queratinócitos, resultando no aparecimento de escamas e placas com diferentes tamanhos. Outra particularidade desta doença é o aumento da vascularização da derme, assim como a presença de um elevado número de células imunitárias, tais como linfócitos T e células dendríticas. Ao nível molecular, pensa-se que as manifestações clínicas e laboratoriais descritas são resultantes da desregulação da complexa rede de citocinas devido à acção combinada das células imunitárias que infiltraram a derme e dos queratinócitos presentes na epiderme. Durante a última década foram identificadas inúmeras espécies de pequenos RNA denominados small non-coding RNAs, que contribuem para a intrincada rede de vias que regulam os genes humanos. Entre estes, os microRNA (miRNA) emergiram como reguladores relevantes da tradução proteica, e actualmente acredita-se que os miRNA participam na regula-ção da maioria dos processos celulares e tecidulares. A pele não é excepção, e de momento os miRNA são intensamente estudados para determinar a sua relevância na regulação da homeostase da pele e no aparecimento de doenças cutâneas. O possível envolvimento de miRNA na patologia da psoríase foi identificado pela primeira vez em 2007, quando a equipa liderada por Sonkoly comparou os perfis de expressão de miRNA em pele psoriática e em pele normal. Entre os miRNA identificados, potencialmente associados à psoríase, o miRNA-203 foi identificado predominantemente em queratinócitos e sobre-expressado em psoríase, quando comparado com a pele normal. Recentemente, a mesma equipa científica demonstrou também que o miRNA-203 e o transcrito de um componente regulador da sinalização da resposta imunitária, o SOCS3 (supressor of cytokine signalling 3), apresentam níveis de expressão inversamente relacionados. Sabe-se ainda que a proteína SOCS3 regula negativamente a activação de um factor de transcrição – STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) – que está sobre-expressado em psoríase e implicado na rede de citocinas. Assim, a sobre-expressão do miRNA-203 em psoríase pode ter importantes implicações na patologia da doença uma vez que impossibilita a expressão de SOCS3, proteína que regula negativamente a rede de citocinas. O objectivo principal deste projecto foi descrever a interacção entre miRNA e a expressão de citocinas em pele humana. Com especial interesse no miRNA-203, o projecto procurou elucidar a função específica dos miRNA moduladores da resposta imunitária na complexa rede de interacções moleculares, levando ao desenvolvimento da doença inflamatória na pele. No começo deste projecto, procurou-se estabelecer um sistema in vitro que permitisse a identificação e análise de potenciais genes-alvo de miRNA associados à psoríase. Assim, através da utilização da proteína Renilla luciferase (R-luc), foi desenvolvido um ensaio repór-ter para a detecção de interacções directas entre o miRNA-203 e diversos elementos da resposta imunitária, através da medição de bioluminescência. Os DNA complementares (cDNA) de seis diferentes citocinas (IL12B, IL15, IL17, IL20, IL24 e TNFα) assim como os cDNA de proteínas supressoras da sinalização das citocinas (SOCS3 e SOCS6) foram fundidos ao gene codificante da R-luc, e as medidas de bioluminescência foram avaliadas quando os vectores codificantes da R-luc foram co-transfectados com um vector expressan-do o miRNA-203 em células HEK293 (Human kidney embryo cells). Dos ensaios desenvol-vidos, identificaram-se três potenciais genes-alvo do miRNA-203: IL24, SOCS6 e TNFα. Para a confirmação da interacção directa entre o miRNA-203 e os genes-alvo mencionados foi desenvolvido um estudo bioinformático para a identificação de sequências nucleotídicas na região 3‟UTR dos genes-alvo complementares à sequência nucleotídica do miRNA-203. Uma vez identificadas as possíveis sequências nucleotídicas que permitem o estabelecimento de interacções entre o miRNA-203 e os RNA mensageiro (mRNA) dos genes-alvo, as sequências identificadas nas regiões 3‟UTR foram mutadas de forma a inibir as interacções miRNA-mRNA. Os transcritos 3‟UTR mutantes dos genes IL24, SOCS6 e TNFα foram fundidos ao gene codificante da R-luc e novos ensaios repórteres foram elaborados. Em paralelo, procedeu-se também ao desenvolvimento de uma linha celular de queratinócitos (denominada HaCaT-203), através da utilização do sistema transposão de DNA “sleeping beauty”, para expressar constitutivamente o miRNA-203. Esta nova linha celular de queratinócitos foi especialmente desenvolvida para a confirmação de potenciais genes-alvo do miRNA-203, através da quantificação dos níveis de expressão dos genes-alvo por qRT-PCR. A quantifi-cação e a análise dos valores de bioluminiscência obtidos a partir da expressão do gene da R-luc fundido aos transcritos dos três 3‟UTR mutantes de IL24, SOCS6 e TNFα identificaram a interacção directa entre os três mRNA e o miRNA-203. Resultados semelhantes foram obtidos através da quantificação dos níveis endógenos dos mRNA de IL24, SOCS6 e TNFα em queratinócitos, confirmando a especificidade da interacção entre o miRNA-203 e os genes-alvo mencionados. A identificação destes novos genes-alvo veio contribuir para a compreensão e caracterização das implicações do miRNA-203 na expressão de citocinas em pele humana. Não menos importante, também foi o facto de que os resultados obtidos vieram consolidar a hipótese de que o miRNA-203 poderá ter implicações na patologia da psoríase uma vez que o miRNA-203 foi identificado como um modulador activo na complexa regulação da rede de citocinas em queratinócitos. A equipa com a qual foi desenvolvido este projecto documentou anteriormente a aplicabilidade terapêutica da utilização de lentivirus para a inibição dos mRNA de TNFα e IL12B através da “entrega” (delivery) de RNA efectores anti-TNFα e anti-IL12B, respectivamente, em pele psoriática humana xenotransplantada em ratos imunodeficientes (xenografted psoriatic skin). No projecto actual, foi desenvolvido um novo vector lentiviral codificando um inibidor de miRNA específico para o miRNA-203 (denominado antagomiR-203). Os RNA efectores anti-miRNA (antagomirs) são caracterizados por sequências oligonucleotídicas complementares aos miRNA de interesse. Assim, os antagomir estabelecem interacções específicas com o miRNA-alvo, conduzindo à inibição funcional dos mesmos. Através da utilização do vector lentiviral codificando o antagomiR-203, vários ensaios in vitro foram desenvolvidos para testar a funcionalidade e a potência do antagomiR-203. Com base nas avaliações funcionais, identificou-se uma nítida sobre-expressão do gene da R-luc quando fundido com uma sequência oligonucleotídica complementar ao miRNA-203, quando co-expresso com o vector lentiviral codificando o antagomiR-203. Foi também identificada uma redução dos níveis de expressão do miRNA-203, quando as linhas celulares de queratinócitos foram infectadas com partículas lentivirais expressando o antagomiR-203. Os resultados obtidos confirmaram assim a funcionalidade e especificidade do antagomiR-203 relativamente ao miRNA-203, permitindo o estabelecimento de uma nova plataforma para a regulação de miRNA através da utilização de lentivirus como veículo de transporte de anti-miRNA. Com base na tecnologia de expressão de antagomir, este projecto procurou ainda abrir caminho para os estudos de gene-alvos endógenos, permitindo experimentalmente estudar a função de miRNA em queratinócitos em pele normal e pele psoriática. Como objectivo final deste projecto, testou-se a aplicabilidade terapêutica da utilização de lentivirus para a “entrega” de RNA efectores anti-miRNA-203 em pele psoriática humana xenotransplantada em ratos imunodeficientes. A administração intradérmica de uma única dose de partículas lentivirais em pele psoriática humana resultou num aumento dos níveis de expressão do miRNA-203 e na não alteração da espessura da epiderme em enxertos de pele tratados com o antagomiR-203. Em conformidade com os resultados obtidos, a avaliação clínica do fenótipo psoriático dos enxertos de pele não identificou nenhuma melhoria clínica e histológica do fenótipo psoriático no ensaio desenvolvido. O potencial para a concepção de medicamentos moleculares baseados na modulação de miRNA endógenos é muito ambicionado, mas actualmente está ainda muito inexplorado. Os estudos desenvolvidos ao longo deste projecto demonstraram que o aumento da expressão do miRNA-203 na patologia da psoríase é complexo, claramente evidenciando a necessidade de estudos futuros para uma melhor compreensão das funções desempenhadas pelos miRNA na regulação da resposta imunitária. O projecto realizado procurou também explorar a aplicabilidade terapêutica de fármacos dirigidos aos miRNA, tendo-se identificado algumas dificuldades relacionadas com a funcionalidade dos antagomirs in vivo. No entanto, é de salientar que a abordagem utilizada neste estudo foi única, na medida em que se procurou explorar uma nova metodologia de administração de antagomirs, permitindo a entrega de material genético em tecidos específicos, de modo a aumentar a segurança na utilização de terapia genética em humanos.
Psoriasis vulgaris is a chronic inflammatory skin disease which is characterized by an excessive growth of skin epithelial cells, increased dermal angiogenesis and infiltration of immune cells into the skin. The past decade has unveiled a plethora of small RNA species that con-tribute to the intricate network of pathways regulating our genes. Among these, microRNAs have emerged as key regulators of translation and are believed to play a role in almost any cellular process and tissue. One of the most upregulated microRNAs in psoriasis skin is miRNA-203. The aim of this study was to describe the interplay between microRNAs, with focus on miRNA-203, and cytokine-encoding mRNAs in human skin. Based on the v-antagomir expression technology, the project may pave the way for studies of endogenous targets, allowing us to experimentally address microRNA function in keratinocytes and skin inflammation. Three components of the cytokine circuit, interleukin-24, suppressor of cytokine signaling-6 and tumor necrosis factor-α, were identified as direct targets for suppression by miRNA-203 by luciferase reporter assay. In the present study, we also used lentiviral vectors as potent carriers of antagomir-encoding gene cassettes. Lentiviral vectors are attractive gene vehicles primarily due to their ability to establish persistent expression owning to genomic integration of the vector DNA reverse-transcribed from virally delivered single-stranded RNA. Potent and persistent knockdown of miRNA-203 expression following transduction of lentiviral vectors encoding antagomiR-203 in keratinocytes was reported. In contrast to the data collected in vitro, miRNA-203 knockdown was not identified in vivo after a three week treatment of xeno-grafted psoriatic skin with lentivirus-encoded antagomiR-203. Our studies consolidate the properties of lentiviral vectors as a tool in experimental dermatology with particular significance for cutaneous RNA managing and in vivo genetic intervention. However, the therapeutic potential of targeting miRNA-203 in psoriasis is here questioned.
