Specific elimination of HIV-1 infected cells using Tat/Rev-dependent circuit

• Author(s): Perdigão, Pedro Ricardo Lucas, 1987-
• Date: 2011
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/6467
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): HIV-1; Terapia génica; Retrovírus; Teses de mestrado - 2011
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Marta, Mariana Santa, 1978-; Caeiro, Filomena, 1950-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011

Despite the success of antiretroviral cocktails, a cure for HIV-1 remains elusive. This is mainly due to the existence of persistent cellular reservoirs infected with non-transcriptional, latent HIV-1. An effective treatment against HIV-1 would target both active and latent HIV-1-infected cells, and eliminate them without harming non-infected cells. In order to achieve this, we have developed a therapeutic plasmid with a Tat/Rev-dependent toxin expression. This vector contains a HIV-1 transcriptional activator to specifically activate latent infected cells. We confirmed the expression of all vector components necessary to achieve our goal. We then assessed the potential of this therapeutic plasmid to specifically eliminate infected cells by transduction of a T-lymphoma cell line that has a HIV-1 latent provirus integrated in its genome. We demonstrated that our therapeutic plasmid is not only capable of reactivating latent HIV-1 expression by itself, but it also can induce cell death efficiently and specifically in HIV-1 infected cells. Cell death was 60% higher in infected cells than in non-infected cells, indicating that our therapeutic vector was able to fulfill the objective proposed in this work. Therefore, the data presented here represents a promising approach for the development of a gene therapy that could become a viable and successful treatment against HIV-1.

O vírus da imunodeficiência humana (VIH) é o agente responsável pelo síndroma de imunodeficiência adquirida (SIDA), caracterizado por uma supressão do sistema imunitário levando à ocorrência de doença oportunistas. Desde a sua descoberta em 1983, o VIH terá sido responsável mais de 25 milhões de mortes em todo o mundo, sendo um dos temas mais investigados actualmente. O VIH é um lentivírus pertencente à família Retroviridae. É um vírus de cadeia de RNA positiva que se encontra encapsidado e que sofre transcrição reversa no interior da célula, originando um intermediário de DNA que é integrado na forma de um provírus no genoma da célula hospedeira. O genoma proviral do VIH codifica nove grelhas de leitura abertas das quais 3 codificam poliproteínas estruturais (Gag, GagPol e Env). Sendo o VIH um retrovírus complexo, este codifica ainda 6 proteínas acessórias responsáveis pela regulação e coordenação do seu fenótipo (Tat, Rev, Nef, Vpr, Vpx e Vif). A proteína Tat (transactivador da transcrição viral) é responsável pelo aumento da expressão do mRNA viral acima de níveis basais. A Tat liga-se a uma estrutura secundária presente no mRNA nascente, recrutando factores de transcrição que vão aumentar o elongamento do mesmo. A proteína Rev (proteína reguladora viral) tem um papel determinante no splicing e no transporte dos mRNAs virais para o citoplasma. Apesar dos avanços no desenvolvimento de terapias contra o VIH-1 através do uso de fármacos antiretrovirais, estes não são capazes de eliminar completamente o vírus do organismo. O maior obstáculo à erradicação do VIH-1 é a existência de reservatórios virais persistentes no hospedeiro. Reservatórios virais são todas as células infectadas com VIH-1 que não são eliminadas do hospedeiro, principalmente devido à capacidade do VIH-1 estabelecer um estado de latência no interior da célula. A latência viral do VIH-1 é caracterizada como um estado de infecção não expressivo que permite a evasão do vírus à resposta do sistema imune, e à acção de fármacos antiretrovirais. Estes reservatórios podem servir como fonte de produção viral. Os principais reservatórios de VIH-1 são os linfócitos T CD4+ de memória, que possuem um tempo de meia-vida prolongado. Deste modo eliminar estes reservatórios virais é extremamente importante. Um tratamento eficaz contra o VIH-1 deve ter como base o desenvolvimento de uma terapia que seja capaz de atingir todas as células infectadas com VIH-1, incluindo as células com VIH latente, sem causar danos a células não infectadas. Deste modo o desenvolvimento de terapias alternativas tal como a terapia génica, mostra especial interesse. A terapia génica consiste na transferência de transgenes para células alvo promovendo a alteração do seu fenótipo. Até ao momento vários tipos de transgenes foram testadas no combate ao VIH-1 (toxinas, anticorpos, interferência de RNA, etc.). O uso de lentivírus como veículos para a transferência e expressão destes transgenes, apresentam diversas vantagens. Os lentivírus são capazes de infectar células que não se encontram activamente a dividir, e apresentam baixa imunogenecidade. No entanto o aparecimento de estirpes replicativamente competentes e mutantes de inserção são um problema. Deste modo, o uso de vectores lentivirais de terceira geração, em que os componentes lentivirais encontram-se divididos por 4 plasmídeos diferentes e a introdução de sinais específicos do tipo celular, permitem aumentar a especificidade e segurança dos vectores lentivirais. O objectivo proposto para este trabalho é o desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica que nos permita eliminar especificamente células infectadas com VIH-1, incluindo os reservatórios latentes. Para atingir este objectivo foi construído um plasmídeo lentiviral que transporta um activador de transcrição (proteínas dedos de zinco e Tat) e uma toxina capaz de induzir a morte celular de células na presença da proteína viral Rev. Uma vez que pretendemos atacar células latentes, na qual a expressão de Rev é inexistente, colocámos no mesmo vector, um activador de transcrição. Este activará a expressão viral, forçando a saída de latência e expondo a célula latente à acção da toxina e consequente morte celular. Esta estratégia pretende promover a morte de células infectadas tomando partido do mecanismo de replicação do VIH-1. De modo a testar esta estratégia, foi inicialmente construída uma proteína de fusão composta pelo domínio activador VP64 e uma proteína dedos de zinco. Foram seleccionadas duas proteínas de dedos de zinco com afinidade para o genoma viral. Estas construções foram testadas para avaliar a sua capacidade de activar a transcrição do VIH-1. Observámos que as proteínas dedos de zinco utilizadas não activaram a transcrição viral, chegando mesmo a inibi-la. Deste modo, determinámos que estas construções não tinham a capacidade de activar a transcrição do VIH-1 e decidimos utilizar a proteína Tat para assumir esta função. Uma vez que a Tat é o activador da transcrição viral do VIH, passámos directamente para o desenvolvimento do vector lentiviral. Utilizámos um vector lentiviral que possui um local de ligação da proteína Rev (RRE) como base para as nossas construções. Este vector tem a particularidade de que, ao iniciar a sua transcrição, os seus mRNAs só são transportados para o citoplasma para tradução na presença de Rev, garantindo que células não infectadas não são afectadas pela expressão dos transgenes. Este vector possui ainda 2 splicing sites do VIH entre os quais foram clonados os genes das toxinas, em fusão com uma proteína repórter fluorescente verde. Estes só são expressos na presença de Rev que se liga aos locais de splicing do mRNA evitando a remoção desta região. Para a construção dos nossos vectores utilizámos a toxina da diphteria (DTA) e a timidina kinase do vírus herpes simplex (HSV-TK), como toxinas de eleição. A DTA promove a morte celular directamente, enquanto a HSV-TK precisa de presença do pró-fármaco Ganciclovir para matar a célula. Clonámos também a proteína Tat em conjunto com uma proteína repórter vermelha sob o controle de um promotor constitutivo, para activar a transcrição dos VIHs latentes e marcar células transduzidas com o nosso vector lentiviral. Todos os componentes do vector encontram-se funcionais, com excepção da, proteína repórter vermelha. Ao testarmos a capacidade do nosso vector eliminar células infectadas num contexto replicativo e de latência, verificámos um aumento de quase 60 % de morte específica de células infectadas. Deste modo concluímos que este trabalho apresenta uma abordagem promissora para o desenvolvimento de uma nova estratégia de terapia genética contra o VIH-1.