The spatiotemporal activity of retinoic acid signaling in the amphyoxus embryo: developmental functions and evolutionary implications

• Author(s): Carvalho, João Emanuel Marques, 1988-
• Date: 2012
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/6719
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Embriologia molecular; Ácido retinóico; Teses de mestrado - 2012
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Schubert, Michael; Sucena, Élio
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

O ácido retinoico (AR) é um morfogénio derivado da vitamina A, que a par com outras vias de sinalização (e.g. factores de crescimento de fibroblasto (FGF), fatores de crescimento de transformador beta (TGF-β), Sonic hedghog (Shh) e Wnt) está envolvido diretamente no desenvolvimento embrionário sendo, por exemplo, fundamental na especificação do eixo ântero-posterior durante fases precoces da embriogénese. A transdução de sinal da via do AR é feita principalmente através de duas famílias de recetores nucleares, os recetores X de retinoides (RXR) e os recetores de ácido retinoico (RAR). Classicamente, estes recetores atuam sob a forma heterodimérica ligando-se especificamente a regiões promotoras, no ADN. Estas regiões são denominadas elementos de resposta ao ácido retinoico (RARE) e são tipicamente caracterizadas pela dupla repetição da sequência conservada (A/G)G(G/T)TCA, ou na forma mais relaxada (A/G)G(G/T)(G/T) (G/C)A, e encontram-se normalmente separadas por um, dois ou cinco nucleótidos. O heterodímero RXR/RAR encontra-se normalmente ligado ao promotor específico, mas na ausência de ligando este recruta um complexo co-repressor, o qual é responsável pela condensação da cromatina e, consequentemente, pela repressão da expressão génica. Na presença do AR, este liga-se ao complexo RXR/RAR no qual induz uma alteração conformacional o que, por sua vez, leva ao recrutamento de co-activadores permitindo a descondensação da cromatina e a ligação do complexo de pré-iniciação da transcrição à região do promotor. O AR é endogenamente sintetizado através de um processo que consiste em duas oxidações. A primeira é reversível e origina retinaldeído a partir de vitamina A, também conhecida como retinol. Esta reação é levada a cabo por enzimas da família das desidrogenases de álcoois e por membros da família das desidrogenases de retinol. A segunda oxidação é uma reação irreversível e transforma o retinaldeído em AR, sendo as desidrogenases de retinaldeído as principais enzimas envolvidas nesta reacção. Além disso, a biodisponibilidade de AR é regulada ao nível da degradação. Este processo é principalmente controlado por enzimas da família de citocromos P450 subfamília 26 (Cyp26) e transforma AR em metabolitos biologicamente menos ativos. Até um passado bastante recente, a via AR foi tida como exclusiva na linhagem dos vertebrados. Porém, estudos mais recentes demonstraram que está presente nas diferentes linhagens de cordados (vertebrados, tunicados e cefalocordados). Por outro lado, estudos recentes recorrendo a bioinformática levaram a que a origem evolutiva da via de sinalização do AR fosse alterada uma vez mais, dada a existência de genes ortólogos a componentes básicos desta via em ambulacrários e lofotrocozoários. Assim sendo, a sinalização por AR tem provavelmente a sua origem na base dos bilatérios. Assim, para um escrutínio detalhado da evolução da via de sinalização do AR e dos seus mecanismos reguladores, o cefalocordado anfioxo (B. lanceolatum) foi usado como modelo animal. Este revelou-se o modelo adequado uma vez que possui uma morfologia e um genoma típicos de vertebrados carecendo, no entanto, de caracteres morfológicos e genómicos associados a inovações obtidas por vertebrados ao longo da evolução como as células da crista neural e a duplicações completas do genoma. Apesar de a maior parte dos estudos que abordam a temática do ácido retinoico, em anfioxo, se focar em genes alvo ativados pelo seu único par heterodimérico RXR/RAR, poucas foram as abordagens para revelar como é controlada a biodisponibilidade do AR durante o desenvolvimento embrionário. Este projecto ambicionou revelar um pouco mais sobre o controlo endógeno de AR, tendo como principal objetivo perceber como é que as três enzimas Cyp26 de anfioxo interagem ao longo do desenvolvimento de forma a controlarem as regiões de influência deste morfogéneo. Com o objectivo de entender as relações filogenéticas entre os diversos genes Cyp26 em bilatérios, foram realizadas análises in silico contemplando informação genómica, nomeadamente a cadeia de aminoácidos destas enzimas. Para a caracterização do padrão de expressão dos três genes Cyp26 durante o desenvolvimento do anfioxo foi utilizada a técnica de hibridação in situ, a qual marca mARN específico através de sondas de ARN, permitindo inferir a expressão de determinado gene. Adicionalmente, a técnica de PCR quantitativo em tempo real permitiu analisar quantitativamente a expressão dos genes de interesse. O objectivo foi analisar detalhada e informativamente a variação da expressão de Cyp26-1, Cyp26-2 e Cyp26-3 em diferentes pontos do desenvolvimento embrionário, num estádio de diferenciação neural e num estádio larvar. Complementarmente e de forma a estudar a influência de AR, uma análise quantitativa foi também realizada em embriões submetidos a tratamentos farmacológicos com AR e BMS009, um antagonista da sinalização por AR. Em simultâneo, embriões submetidos a tratamentos farmacológicos foram analisados de forma a visualizar os locais de ocorrência de transcrição de Cyp26s recorrendo, uma vez mais, à técnica de hibridação in situ. Os resultados aqui apresentados revelam, em simultâneo, dados interessantes e limitações que futuramente devem ser contornadas. Do ponto de vista evolutivo, a nossa análise filogenética revela que as sequências de Cyp26 de vertebrados incluídas na análise, devido ao seu arranjo na árvore obtida, recapitulam as duplicações completas do genoma descritas durante a diversificação deste grupo. Adicionalmente, o arranjo filogenético para os genes de anfioxo sugerem que estes terão sido originados através de uma duplicação específica de linhagem ocorrida em cefalocordados. O padrão de expressão dos genes Cyp26 de anfioxo apresenta um arranjo bastante complexo, quer em termos espaciais quer em termos temporais: ambos os Cyp26-1 e Cyp26-3 apresentam uma expressão bastante pouco marcada e que aparenta ser restrita a estruturas mesodermais. Por oposição, Cyp26-2 apresenta uma expressão bastante evidente desde uma fase incial do desenvolvimento (gastrulação) que se mantem até a um estado larvar avançado. Este gene é expresso maioritariamente em duas regiões: posteriormente, onde deverá ser responsável por criar um ambiente permissivo para as células do blastóporo antes da neurulação e numa fase tardia, onde estará envolvido na especificação de estruturas ectodermais da cauda; e anteriormente, onde a sinalização é fundamental para evitar os efeitos deletérios do AR na especificação de estruturas anteriores, derivadas de todas as camadas germinativas e sendo, mais tarde no desenvolvimento, essencial para a degradação do AR em estruturas derivadas da faringe, tal como a boca. Combinando as informações obtidas através de qRT-PCR numa situação controlo e em embriões submetidos a tratamentos de AR e BMS009 com o padrão de expressão obtido com a técnica de hibridação in situ sob as mesmas condições farmacológicas, é possível sugerir que todos os Cyp26 de anfioxo estão sob o controlo AR, embora nem todos apresentem a mesma sensibilidade. Concomitantemente, Cyp26-2 aparenta ser o principal regulador da padronização dependente da degradação de AR durante o desenvolvimento embrionário e, por sua vez, Cyp26-1 e Cyp26-3 devem efetivamente apresentar uma função quase nula no que toca a este capítulo. No entanto, devem ser as principais enzimas recrutadas no caso de uma situação na qual exista excesso de retinóides. Assim, estes dois genes parecem ter desenvolvido uma função marginal que funciona como um tampão interno para a manutenção da homeostasia de AR. Em suma, este estudo apresenta as primeiras evidências experimentais do envolvimento de Cyp26s no desenvolvimento embrionário de anfioxo revelando, simultaneamente, novos detalhes sobre a história evolutiva da cascata de sinalização do AR.

Retinoic acid (RA) is a potent morphogen, derived from vitamin A, which exhibits crucial functions during development. Transduction of the RA signal is driven by two nuclear receptors, working as heterodimers, the retinoid X receptor (RXR) and the retinoic acid receptor (RAR), that are responsible for activation of the transcription of target genes. Endogenous RA is synthesized by the irreversible oxidation of retinal to RA by retinaldehyde dehydrogenases, and is degraded by Cyp26 enzymes. Initially described as being specific to vertebrates and subsequently to chordates, recent in silico studies locate the evolutionary origin of the RA signaling cascade at the base of the bilaterian animals. To fully understand the evolution of RA signaling as well as the mechanisms governing its developmental functions, the cephalochordate amphioxus constitutes an ideal model. Amphioxus is characterized by a vertebrate-like morphology and genome, yet lacking key morphological innovations of vertebrates, such as definite a neural crest, and the whole genome duplications characterizing vertebrates. Most studies on RA signaling in amphioxus have focused on the targets activated by the single amphioxus RXR/RAR heterodimer and not much is known about the bioavailability of endogenous RA in the amphioxus embryo. Here, we address this question from the perspective of RA degradation. We demonstrate that, in amphioxus (Branchiostoma lanceolatum), there are three Cyp26 genes which have originated by lineage-specific duplication. In situ hybridization studies show that only one of the three Cyp26 paralogs is characterized by conspicuous developmental expression indicating that it may single-handedly mediate the majority of Cyp26-dependent developmental patterning functions. Concomitantly, qPCR analyses suggest that the lineage-specific duplication of Cyp26 genes, which has occurred in the cephalochordates, might have contributed to the development of a mechanism that controls and avoids the teratogenic effects associated with excess or lack of endogenous RA.