Insights on the biodegradation of acrylic reline resins

• Author(s): Neves, Cristina B
• Date: 2012
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/6774
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Biodegradação; Resinas; Citotoxicidade; Reabilitação oral; Teses de doutoramento - 2012
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Lopes, Luís Pires, 1960-; Bettencourt, Ana Maria dos Santos, 1960-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de doutoramento, Medicina Dentária (Reabilitação Oral), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina Dentária, 2012

Acrylic reline resins are extensively used in dentistry, since they readapt dentures to the continuous reabsorbed underlying tissues. Since present in the oral cavity for long periods of time, these materials are objective of the biodegradation phenomena, which represents the change on their chemical, physical and mechanical properties due to the oral environment conditions and its constituents. These processes may permanently alter the properties of the material and compromise its function. In addition, they can promote leachable products, which in turn may induce a series of biological responses on cells and tissues. The biodegradation impact on the biocompatibility of acrylic materials is controversial but concern about its clinical significance is a fact as subjective and objective complaints about these materials are increasing. Acetylcholinesterase (AChE) has been reported to degrade methacrylatebased monomers and had a strong catalytic activity when tested in human saliva. Hence, it was the aim of chapter two of the current work to determine the effect of the enzyme AChE on the degradation of three acrylic reline resins, Probase Cold, Kooliner and Ufi Gel Hard, which contain the monomers methylmethacrylate (MMA), isobutylmethacrylate (IBMA) and 1,6- hexanodioldimethacrylate (HDMA), respectively, through the quantification of residual monomer and one common by-product methacrylic acid (MA) by High- Performance Liquid Chromatography (HPLC). These monomers were first incubated with AChE and their respective hydrolysis was monitored. The study of the degradation of the resins was done by incubating specimens of each material in 5 mL of buffer or 5 mL of buffer with AChE at 5 U/mL (pH 7.4, 37º C) for 72 h. To simulate the short-term and a long-term usage of the resins in the oral cavity, two endpoints were established: immediate exposure and late exposure. Immediate exposure was studied in eluates of specimens incubated immediately after polymerization. Late exposure was studied after specimens were submitted to an aqueous environment aging procedure and then, after a thermocycling aging treatment. On the three experiments, aliquots from the eluates were taken every 24 h and analysed by HPLC. HPLC-Mass spectrometry was executed to confirm the release of the compounds and to search for new degradation products promoted by AChE hydrolysis. AChE demonstrated greater affinity to IBMA than to MMA and HDMA was resistant to its catalytic action. Upon aging treatments, the Probase Cold specimens were not affected by AChE hydrolysis and Kooliner specimens showed an increment in the production of the by-product MA, but only in specimens incubated with AChE. Ufi Gel Hard specimens showed production of MA, even when the residual monomer was proved to be resistant to AChE. These biodegradation experiments showed that the specificity of hydrolysis by this enzyme depends on the composition of the resins, and also, on the chemistry and solubility of the monomers. After the evaluation of the effect of AChE on the biodegradation of the acrylic reline resins, the role of the enzyme on the cytotoxicity of acrylic reline resins eluates, using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide (MTT) reduction assay, was studied in chapter number three of this work. Cytotoxicity of the residual monomers and the by-product (MA) was also evaluated. Cultured adult human dermal fibroblasts were exposed to multiple concentrations of resin´s eluates and standard compounds solutions. The specimens were immersed and incubated in 5 mL of culture medium (control group) and 5 mL of culture medium with AChE at 5 U/mL (experimental group) for 72 h at 37ºC. Enzyme, negative and positive controls were used. The cell viability of cultures exposed to all dilutions of Probase Cold was statistically similar to the negative control. Control Kooliner specimens decreased almost 90% in cell viability and control Ufi Gel Hard specimens almost 20%. AChE changed these values only slightly, meaning that Kooliner maintained as a severely cytotoxic material and Ufi Gel Hard as slightly cytotoxic. The cellular viability studies after fibroblasts were exposed to standard compounds solutions alone, led to the conclusion that the results of cytotoxicity of resins could not be explained only by cytotoxicity of expectable and known leachable compounds and degradation by-products. In spite of not being an isolate causing factor, the residual monomers present in the acrylic resins and leached into the medium were considered a very important toxic agent that can promote adverse reactions on tissues of the oral cavity. For this reason, effective post-polymerization treatments that reduce the monomer content of the resins, based in several concentrations of ethanol and different temperatures were tested in the chapter number four of this work. They were evaluated on the resins that were found to be cytotoxic to fibroblasts in our previous chapter, Kooliner and Ufi Gel Hard. Hence, the residual monomer content, flexural strength, microhardness and degree of conversion of these resins were measured. After polymerization, specimens were immersed in water, 20%, 50% or 70% ethanol solutions at 23±2ºC or 55±2°C for 10 minutes. Controls were left untreated. HPLC was used for the determination of residual monomer content. Specimens were submitted to Vickers microhardness and 3-point loading flexural strength tests. Degree of conversion was analyzed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy. Specimens submitted to 55±2°C showed reduction of the residual monomer content, when compared to specimens submitted to 23±2°C. Higher concentrations of ethanol promoted lower residual monomer contents at 55±2°C in both materials, but not at 23±2°C. The mechanical properties were maintained after 50% ethanol treatment in Kooliner specimens and after 20% ethanol treatment in Ufi Gel Hard specimens. After treatment, degree of conversion remained the same on Kooliner specimens and increased on Ufi Gel Hard specimens. Immersion of relined dentures in specific ethanol solutions at 55ºC for 10 minutes was considered an effective, expeditious and easy post-polymerization treatment to reduce the amount of residual monomer, while maintaining reline resins´s mechanical properties.As resinas acrílicas de rebasamento são frequentemente utilizadas em Medicina Dentária e têm como principal função a readaptação das próteses removíveis aos tecidos de suporte reabsorvidos. Na cavidade oral estão sujeitas ao fenómeno de biodegradação, o qual pode levar à alteração das suas propriedades químicas, físicas e mecânicas. Além disso, este fenómeno pode promover a libertação de compostos químicos que, por sua vez, podem induzir respostas biológicas nas células e tecidos da cavidade oral. O impacto biológico da biodegradação das resinas acrílicas é controverso, existindo dúvidas sobre as suas reais implicações clínicas. Na literatura têm sido descritos sinais e sintomas de intolerância associada a estes materiais, o que é motivo de grande preocupação. A degradação dos monómeros de metacrilato pela enzima acetilcolinesterase (AChE) já foi anteriormente confirmada, tendo-se observado uma forte atividade catalítica quando estudada na saliva humana. Assim sendo, o objetivo do capítulo número dois deste trabalho foi a determinação do efeito da enzima AChE na degradação química de três resinas acrílicas de rebasamento, Probase Cold, Kooliner e Ufi Gel Hard, que contêm na sua composição, respectivamente, os seguintes monómeros: metilmetacrilato (MMA), isobutilmetacrilato (IBMA) e 1,6-hexanodioldimetacrilato (HDMA). A quantificação dos monómeros residuais e de um produto de degradação comum, o ácido metacrílico (MA) foi realizada através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Previamente, os monómeros foram incubados com a enzima AChE e a hidrólise dos monómeros foi monitorizada. O estudo da degradação das resinas foi realizado através da incubação de espécimes de cada material em 5 mL de solução tamponada ou em 5 mL de solução tamponada com AChE a 5 U/mL durante 72 horas, com pH de 7.4 a 37ºC.

Para simular as condições aguda e crónica da utilização destas resinas na cavidade oral foram estabelecidos dois momentos: a exposição imediata e a exposição tardia. A primeira foi estudada através de extratos de resinas acrílicas incubadas imediatamente após a reação de polimerização. A segunda foi estudada após os espécimes terem sido submetidos a um procedimento de envelhecimento aquoso e, subsequentemente, após um tratamento de envelhecimento provocado por termociclagem. Nos três procedimentos experimentais foram retiradas alíquotas em cada 24 horas e foi realizada a análise dos compostos por HPLC. A confirmação da existência dos compostos nos extratos das resinas acrílicas e a pesquisa de novos produtos de degradação formados pela hidrólise promovida pela enzima AChE foi feita através do estudo de espectrometria de massa associada a HPLC. A enzima AChE demonstrou maior afinidade para o monómero IBMA do que para o monómero MMA. O monómero HDMA demonstrou ser resistente à ação catalítica desta enzima. Após os tratamentos de envelhecimento, os espécimes da resina Probase Cold não demostraram ter sido afetados pela hidrólise enzimática, e os espécimes da resina Kooliner revelaram um incremento na produção do produto de degradação MA, mas apenas nos espécimes incubados com a enzima AChE. Os espécimes da resina Ufi Gel Hard revelaram a produção de MA, mesmo quando o monómero residual HDMA provou ser resistente à ação da AChE. Deste estudo é possível concluir que a hidrólise promovida pela enzima AChE depende da composição das resinas, bem como da estrutura química e solubilidade dos monómeros. Após ter sido realizada a avaliação do efeito da AChE na biodegradação das resinas acrílicas de rebasamento, no capítulo três deste trabalho estudou-se o papel da enzima na citotoxicidade dos extratos dessas resinas. Com esse objetivo utilizou-se o ensaio de redução do brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5 difenil-2H-tetrazólio (MTT) para determinar a viabilidade celular de culturas primárias de fibroblastos humanos. Os espécimes de cada resina foram incubados em 5 mL de meio de cultura (grupo controlo) ou em 5 mL de meio de cultura com 5 U/mL de AChE (grupo experimental) durante 72 horas a 37ºC. A citotoxicidade de soluções dos monómeros residuais MMA, IBMA e HDMA e do produto de degradação MA foi também avaliada. As culturas primárias de fibroblastos humanos foram expostas a várias concentrações, tanto dos extratos das resinas como das soluções padrão dos compostos isolados. Paralelamente, foram utilizados grupos de controlo negativo, de controlo positivo e da ação da enzima nas células. A viabilidade celular das culturas expostas a todas as diluições dos extratos da resina Probase Cold foi semelhante ao controlo negativo. Os espécimes do grupo controlo da resina Kooliner apresentaram uma redução de viabilidade celular de quase 90%, sendo que o grupo controlo da resina Ufi Gel Hard teve uma redução de aproximadamente 20%. Os grupos experimentais, com a enzima AChE, tiveram resultados estatisticamente diferentes, embora a diferença tenha sido bastante ligeira. Assim, a resina Kooliner demonstrou ser um material bastante citotóxico e a resina Ufi Gel Hard um material ligeiramente citotóxico, independentemente da acção da AChE. O estudo da viabilidade celular, após exposição a soluções padrão dos monómeros e produto MA, permitiu concluir que a citotoxicidade destes materiais não pode ser explicada apenas pela toxicidade isolada dos monómeros libertados e do produto de degradação comum. Apesar de não serem o único fator, os monómeros residuais das resinas acrílicas de rebasamento, libertados para o meio oral, são considerados como agentes potencialmente tóxicos promotores de reações adversas dos tecidos da cavidade oral. Com o objectivo de reduzir a libertação de monómero residual, no capítulo quatro deste trabalho são propostos vários tratamentos a realizar após a polimerização das resinas acrílicas, baseados em diferentes concentrações de etanol e diferentes temperaturas. O estudo foi realizado para as resinas acrílicas de rebasamento direto na cavidade oral, Kooliner e Ufi Gel Hard, já que os seus extratos mostraram, no capítulo três deste trabalho, citotoxicidade em fibroblastos humanos. Assim, foram avaliados o teor do monómero residual presente nas resinas, a sua resistência à flexão, a sua dureza e o seu grau de conversão. Após a polimerização, os espécimes das duas resinas foram submetidos a um dos seguintes tratamentos: imersão em água ou em soluções de etanol a 20%, 50% ou 70%, a uma temperatura de 23±2ºC ou de 55±2ºC durante 10 minutos. Como controlo, foram utilizados espécimes que não foram submetidos a qualquer tratamento pós-polimerização. A determinação do teor de monómero residual das resinas foi realizada através de HPLC. Os espécimes de cada grupo foram submetidos a testes de microdureza Vickers e, de seguida, a testes de resistência à flexão com três pontos de carga numa máquina de testes universal. O grau de conversão das resinas foi determinado, antes e após os tratamentos pós-polimerização, através de espectroscopia de infra vermelhos com transformada de Fourier. Em ambas as resinas estudadas, os espécimes tratados com soluções à temperatura de 55±2ºC apresentaram redução do teor de monómero residual, a qual foi mais acentuada comparativamente com os espécimes tratados com soluções à temperatura de 23±2ºC. O etanol, em concentrações mais elevadas, promoveu uma maior redução do teor de monómero residual em ambas as resinas submetidas a uma temperatura de 55±2ºC. O mesmo resultado não foi encontrado em espécimes submetidos a 23±2ºC, o que evidencia um efeito sinergético entre a concentração de etanol e a temperatura. As propriedades mecânicas não se alteraram após os tratamentos com etanol a 50%, nos espécimes da resina Kooliner, e após o tratamento com etanol a 20%, nos espécimes da resina Ufi Gel Hard. Após cada um dos tratamentos, o grau de conversão manteve-se nos espécimes da resina Kooliner, e aumentou nos espécimes da resina Ufi Gel Hard. A imersão de próteses removíveis rebasadas com resinas de rebasamento direto em soluções específicas de etanol a 55ºC, durante 10 minutos, foi considerado um tratamento póspolimerização eficaz para a redução do teor de monómero residual. Além de ser fácil e de rápida aplicação, este tratamento com etanol não prejudicou as propriedades mecânicas das duas resinas acrílicas de rebasamento direto estudadas.