Environmental chemicals and fetal testis development of human and rat

• Author(s): Calarrão, Ana Isabel Alves Gil Barrera,1989
• Date: 2012
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/7032
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Fertilidade humana; Exposição ambiental; Teses de mestrado - 2012
• Document Type: Master thesis
• Language: Portuguese
• Advisor(s): Gama, Augusta; Sharpe, Richard M.
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012

Ao longo das últimas cinco décadas tem vindo a registar-se um decréscimo da taxa de fecundidade humana. Embora existam vários factores que contribuam para tal (por exemplo, alterações nos comportamentos sociais), são cada vez mais comuns problemas fisiológicos masculinos, como a diminuição da concentração e qualidade espermática, que devem ser também considerados importantes. Adicionalmente, doenças como hipospádias, criptorquidismo e cancro testicular têm também vindo a aumentar de incidência. Devido ao curto período de tempo em que se registam estas grandes diferenças, parece pouco provável que haja apenas influência genética a actuar. Como em tantos outros problemas recentes, a combinação das variações do estilo de vida e da exposição ambiental a moléculas perigosas pode prejudicar o desenvolvimento do sistema reprodutor masculino, diminuindo assim a fertilidade. Foi proposta uma origem comum na vida fetal para as doenças acima referidas, em que uma função deficiente das células somáticas do testículo fetal resultaria numa ruptura da organização e desenvolvimento normal, traduzindo-se em problemas reprodutivos masculinos. Esta teoria dá pelo nome de Síndrome da Disgénese Testicular (Testicular Dysgenesis Syndrome, TDS) e mostra o quão importante é o desenvolvimento fetal das estruturas reprodutivas masculinas para uma saúde e função reprodutiva normal posterior. Uma das doenças incluídas nesta TDS é o cancro testicular com origem na linha germinal (testicular germ cell cancer, TGCC), ao qual é atribuído a maioria das mortes relacionadas com problemas de saúde em homens entre os 15 e os 35 anos e cuja incidência duplicou nos últimos 40 anos. Durante o desenvolvimento fetal no Homem, as células germinais masculinas indiferenciadas mantêm a sua proliferação em níveis baixos após a perda de pluripotência e passagem para um estado diferenciado. Esta perda de pluripotência parece conter a hipótese de como a TGCC surge nos humanos, visto que se o processo for perturbado por factores externos, as células podem entrar num estado intermediário em que mantêm a taxa de proliferação alta, adquirindo características cancerígenas. Um tipo de molécula ambiental ao qual os fetos estão expostos, e que já demonstrou afectar negativamente o sistema reprodutor masculino noutras espécies, são os ftalatos, componentes industriais cuja exposição em roedores levou ao aparecimento de condições semelhantes às da TDS. No entanto, não há informações sobre o seu efeito nos humanos. Outros químicos ambientais cujo efeito no desenvolvimento reprodutivo pode ser negativo são os anti-inflamatórios não esteróides, tais como o paracetamol e a indometacina. Embora o mecanismo exacto ainda não seja conhecido, ambos actuam através da inibição da produção ou acção de prostaglandinas, que são lípidos libertados pelas células quando ocorre uma inflamação, embora a indometacina seja considerada um supressor mais inequívoco do que o paracetamol. A administração de paracetamol e outros analgésicos demostrou ter efeitos negativos na saúde reprodutiva em roedores. Esta tese centrou-se no estudo do efeito da exposição a químicos ambientais como o ftalato di(n-butyl) (di(n-butyl) phthalate, DBP), paracetamol e indometacina no desenvolvimento e diferenciação das células germinais fetais, baseando-se em estudos preliminares e não publicados desenvolvidos pelo grupo de investigação em que me inseri. Para estudar o efeito do DBP, foram recolhidos testículos de fetos humanos (n = 8), com idades compreendidas entre as 14 e 20 semanas de gestação, para serem xeno-enxertados debaixo da pele dorsal de ratos imunodeficientes adultos (machos castrados) em porções pequenas. Sete dias após esta operação, os quais permitem o estabelecimento de irrigação sanguínea nos enxertos, os hospedeiros recebem doses diárias de controlo, DBP ou MBP (ftalato monobutyl, o metabolito activo do DBP) dissolvidos em óleo (500mg/kg/dia), durante 21 dias. Os hospedeiros ainda são sujeitos a três injecções semanais de gonadotropina coriónica humana (20 IU), para replicar as condições normais de gravidez e manter a produção de testosterona. Após o período de tratamento, os enxertos são recolhidos, fixados, cortados em secções e sujeitos a uma imunofluorescência tripla. No total, analisaram-se pelo menos dois enxertos controlos e dois expostos a DBP/MBP para cada feto, resultando, no mínimo, em 32 amostras. O protocolo de imunofluorescência permite visualizar células germinais com antigénios para OCT3/4 (células germinais indiferenciadas), MAGE-A4 (células germinais diferenciadas) e Ki67 (células em proliferação). As imagens foram obtidas por microscopia confocal e as células incluídas num túbulo seminífero definido, que demonstrassem fluorescência para estes antigénios, foram assumidas como pertencendo à linha germinal e contadas manualmente. Os valores registados para os enxertos-controlo e expostos a DBP, do mesmo feto, foram condensados até se obter um valor médio respectivo. A média dos enxertos controlo e dos expostos ao tratamento, de cada um dos fetos, foi utilizada então para análise estatística, usando-se um Teste t para amostras emparelhadas (significância: P<0.05). Os resultados mostraram que os enxertos expostos ao DBP(MBP) registam uma diminuição significativa de mais de 10% na percentagem de células germinais positivas para OCT3/4 (indiferenciadas). Por outro lado, a percentagem de células germinais positivas para MAGE-A4 (diferenciada) em enxertos tratados com DBP(MBP) foi significativamente maior do que os controlos. Porém, a proliferação das células germinais indiferenciadas e diferenciadas não registou alterações significativas em comparação com as amostras controlo. As células germinais reduziram a expressão de OCT3/4 para aumentarem a expressão de MAGE-A4 quando se diferenciaram, o que coincidiu com a redução, e eventualmente a perda, da capacidade proliferativa, demonstrando que o modelo dos xeno-enxertos consegue recapitular o desenvolvimento fetal normal das células germinais masculinas nos humanos. Estes resultados parecem dever-se a uma apoptose selectiva das células indiferenciadas. Se a apoptose fosse geral, a proporção de células germinais indiferenciadas e diferenciadas não mudava após o tratamento com o DBP(MBP), o que não está de acordo com os resultados obtidos, já que há um aumento de células germinais diferenciadas. Devido à falta de dados sobre o efeito do DBP nas gónadas masculinas humanadas, esta hipótese estaria de acordo com dados anteriores de estudos in vitro e in vivo, em humanos e roedores respectivamente, em que a exposição a DBP reduz o número de células germinais fetais positivas para OCT3/4. O segundo projecto desenvolvido e abordado nesta tese foi analisar os efeitos da exposição ao paracetamol e indometacina no número de células germinais nos testículos fetais de ratos. Fêmeas prenhas de ratos Wistar foram tratadas diariamente com paracetamol (350mg/kg/dia), indometacina (1mg/kg/dia ou 0.8mg/kg/dia) ou tratamento controlo. O tratamento decorreu entre o dia embrionário (e) 15.5 até ao e20.5, sendo os testículos dos descendestes recolhidos ao e21.5. As amostras foram fixadas, seccionadas e processadas através de um protocolo imunohistoquímico para o antigénio VASA (marcador típico de células germinais). O número de células germinais foi obtido por estereologia, que é um método uniforme e sistemático que permite analisar a composição celular de um tecido tridimensional, neste caso o testículo, através da contagem de núcleos de células germinais em secções bidimensionais desse mesmo tecido. Para as amostras fetais e21.5, foram contadas todas as células que expressassem VASA e que estivessem contidas num túbulo seminífero definido. A comparação entre amostras controlo e as expostas a paracetamol/indometacina foi analisada estatisticamente através de uma análise de variância ANOVA (significância: p<0.05). Os resultados mostraram uma redução significativa do número de células germinais em amostras expostas à indometacina, quando comparadas com as de controlo. Embora as gónadas masculinas expostas ao paracetamol não tenham apresentado uma diferença significativa, existe uma tendência para a redução do número de células germinais. O desenvolvimento normal das células germinais no rato passa por perderem totalmente a capacidade proliferativa quando se diferenciam, num processo síncrono e uniforme, ao contrário dos humanos. Não se sabe se o decréscimo do número de células pode ser atribuído a apoptose devido à falta de dados nesta área, mas a indometacina pode induzir um aumento da taxa de diferenciação das células germinais fetais, levando à paragem da divisão celular numa idade anormalmente precoce. Outro ensaio experimental foi desenvolvido para investigar o efeito da exposição in utero à indometacina no número de células germinais em testículos de ratos obtidos no dia 25 após o nascimento (postnatal day, pnd25). O protocolo para investigar este efeito foi em tudo idêntico ao seguido para os testículos e21.5, excepto que não houve amostras expostas ao parecetamol e os testículos foram recolhidos após o nascimento (embora o período de exposição à indometacina tenha sido de e15.5 a e18.5). Visto que a gónada pnd25 já produz espermatozóides, as células germinais foram divididas em categorias que correspondem à progressão temporal da espermatogénese: espermatogónia, espermatócito I e espermatócito II. O número de células germinais de cada categoria, mais o número total de células germinais, foi contado também através de esterologia e a comparação estatística entre amostras controlo e tratadas com indometacina foi feita com um Teste t de Student (significância: p<0.05). Os resultados mostraram que o número de espermatogónias e o número total de células germinais aumentaram significativamente em amostras tratadas com indometacina, enquanto os valores para espermatócitos I e II não sofreram alterações significativas. Isto sugere que a exposição in utero à indometacina possa induzir apoptose nas células germinais e aquelas que resistem conseguem recuperar, embora faseadamente, os seus números normais após o nascimento e cessação do período de tratamento. Além disso, ambos os ensaios em ratos mostram que, pelo menos em mamíferos, o desenvolvimento fetal normal das células germinais, e posterior fertilidade dos indivíduos, é dependente de prostaglandinas. Este conjunto de estudos mostrou que a exposição fetal a químicos ambientais comuns, tais como os ftalatos e inibidores de prostaglandinas, pode afectar o desenvolvimento fetal das células germinais nos humanos e no rato, obtendo-se dados sobre este tema pela primeira vez.

Lifestyle and environmental exposure to hazardous molecules have been indicated as a cause for the decrease in human fertility. An increased incidence of hypospadias, cryptorchidism and testicular germ cell cancer has been reported and it has been hypothesized that these may form a Testicular Dysgenesis Syndrome (TDS) with a common origin in fetal life. Although testicular germ cell cancer (TGCC) occurs in young men, it appears that it arises from a failure of fetal germ cells to lose their pluripotency and which then transform into carcinoma-in-situ (CIS) cells, which are germ cells (GC) with pluripotency and proliferative features that probably lead to TGCC in young adulthood. It has been hypothesized that exposure in utero to some environmental factors could play a role in disturbing the testicular endocrine function in the fetus, possibly leading to TGCC. Di(n-butyl) phthalate (DBP), a common environmental chemical, has been shown to affect fetal testis development and endocrine function in the rat. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (paracetamol, indomethacin), which are believed to work through inhibition of prostaglandins, and other inflammation modulators can also affect fetal testis endocrine function in animal models. This study therefore aimed to assess the effect of DBP, paracetamol and indomethacin exposure on fetal GC development and differentiation. To study DBP effects, second-trimester human testis pieces from eight fetuses were xenografted under the backskin of nude castrated male mice, which were then treated with vehicle (control) or DBP for 21 days. Immunofluorescence for OCT3/4 (undifferentiated GC marker), MAGE-A4 (differentiated GC marker) and Ki67 (proliferative cell marker) was used to analyse GC differentiation and proliferation. Exposure to DBP led to a reduction in proportion of undifferentiated GC, although proliferative features were maintained, possibly due to selective apoptosis. To analyse the effect of indomethacin on GC numbers, e21.5 and pnd25 rat testes were evaluated in males exposed in utero to vehicle (control) or indomethacin (1mg/kg or 0.8mg/kg) treatment. Immunohistochemistry for VASA (GC marker) and stereology was used to assess GC number in e21.5 testes and spermatogenic temporal progression in pnd25 testes. Indomethacin exposed e21.5 rat testes showed a significant decrease in GC number, which is in agreement with preliminary results. Pnd25 rat testes from males exposed in utero to indomethacin showed an increase in spermatogonial numbers and total GC number, although the numbers for early and pachytene spermatocytes were not different. This shows that indomethacin affects germ cell development during the exposure period and that there might be a staggered recovery after birth toward normal GC number. Overall, these results show for the first time that exposure to common environmental chemicals affect human and rat male fetal GC development.