Author(s): Covas, Gonçalo Neff Valadares Gomes
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/7961
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): H2O2; Adaptação; Estado estacionário; Teses de mestrado - 2011
Author(s): Covas, Gonçalo Neff Valadares Gomes
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/7961
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): H2O2; Adaptação; Estado estacionário; Teses de mestrado - 2011
Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011
O modelo de activação do sistema NrF2/Keap1 ainda não se encontra bem elucidado, havendo inconsistência no que toca ao mecanismo de activação da proteína NrF2. A hipótese estabelecida na literatura é que uma activação do sistema passa pelo dissociar do complexo NrF2-Keap1 em resposta a estímulos indutores do sistema. Porém encontram-se igualmente registadas observações que suportam que uma activação do sistema NrF2/Keap1 passa pela acumulação da proteína NrF2 por síntese de novo e uma ineficiente degradação proteossomal da mesma por saturação da proteína Keap1. Ainda é de salientar que a maioria dos estudos de activação do NrF2 são realizados pela exposição a fármacos e/ou concentrações de H2O2 elevadas (~10-3 M), condições que não mimetizam a sinalização via H2O2 observada in vivo (10-7 a 10-9 M) e por recurso à sobreexpressão da proteína NrF2. Neste trabalho praticaram-se condições próximas das fisiológicas e não se recorreu à sobreexpressão das proteínas NrF2 e/ou Keap1, o que aproxima o presente trabalho das condições fisiológicas. Concluiu-se que o sistema NrF2/Keap1 comporta-se de maneira distinta consoante o método de exposição ao H2O2 empregue. Por adição bolus (50 e 100 μM) observou-se somente um aumento dos níveis nucleares da proteína NrF2, enquanto em exposição por estado estacionário (12,5 μM) observou-se um aumento dos níveis citosólicos da proteína NrF2 anterior ao aumento do nível nuclear da mesma. Ainda se observou por imunofluorescência, que a proteína NrF2 em condições basais apresenta baixos níveis citosólicos. Também se observou que uma exposição prolongada (4 horas) a 12,5 μM H2O2 em estado estacionário conduziu a uma terminação da activação do sistema NrF2/Keap1. Finalmente, sugere-se que o mesmo sistema participe no processo de adaptação ao stress oxidativo em células HeLa.
The molecular mechanism of NrF2/Keap1 system activation is still not well understood, duo to disagreement regarding the mechanism of NrF2 protein activation. The hypothesis established in literature is that activation of the system involves dissociation of the Nrf2- Keap1 complex in response to stimuli. But there are also observations that support activation of NrF2/Keap1 system by accumulation of NrF2 protein by de novo synthesis and inefficient proteossomal degradation, duo to saturation of the Keap1 protein. It is noteworthy that most studies of NrF2 activation are carried out by exposure to high concentrations of drugs and/or H2O2 (~ 10-3 M), conditions that do not mimic the H2O2 signaling pathway observed in vivo (10-7 to 10-9 M) and by means of overexpression of Nrf2 protein. This work, accomplished under near-physiological conditions and not resorting to overexpression of NrF2/Keap1 proteins, simulates physiological conditions better. We established that the NrF2/Keap1 system behaves differently depending on the method by which cell are exposed to H2O2. For 50 to 100 μM H2O2 bolus additions, an increase in nuclear levels of NrF2 protein was observed, while under a 12.5 μM H2O2 steady-state exposure an increase in cytosolic NrF2 levels prior to the increase of the nuclear NrF2 levels was observed. It was also observed by immunofluorescence that, under basal conditions, NrF2 is mainly presented in the nucleus. It was also perceived that prolonged exposure (4 hours) to 12.5 μM H2O2 by steady-state led to termination of the activation of the NrF2/Keap1. This work also proposes that NrF2/Keap1 system partakes in adaptation process to oxidative stress in HeLa cells.