Author(s): Fernandes, Ana Miguel Guterres Coelho, 1988-
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/8017
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Biologia molecular; microRNA; Splicing alternativo; DNA; RNA; Teses de mestrado - 2012
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
As proteínas EWS (Ewing sarcoma breakpoint region 1), FUS [Fused in sarcoma ou TLS (Translocated in liposarcoma)] e TAF15 (TATA box binding protein-associated factor) fazem parte da família de proteínas denominada FET (FUS, EWS e TAF15). A região amino-terminal destas proteínas é composta por um domínio de activação transcricional enquanto a região C-terminal é constituída pelo domínio de ligação ao RNA, onde existem locais de interacção com os ácidos nucleicos. Desta forma, as proteínas FET são capazes de se ligar a moléculas de RNA e DNA. Interagem também com várias proteínas e factores de transcrição, tendo sido implicadas em diversos processos celulares. As proteínas FET participam na regulação da transcrição, splicing geral e alternativo, reparação de DNA, transporte de RNA mensageiro (mRNA) e transitam entre o núcleo e o citoplasma (nucleo-cytoplasmic shuttling). Adicionalmente, foram identificadas num complexo proteico que inclui a enzima Drosha, designado “Drosha large complex”. A enzima Drosha é um dos principais constituintes do Complexo Microprocessador que é responsável pelo processamento de microRNA (miRNA) primários a miRNA percursores. Porém, o envolvimento das proteínas FET no processamento de miRNAs não foi ainda esclarecido. Estas proteínas foram também relacionadas com patologias humanas, tendo sido identificadas como fusões proteicas em vários tipos de cancro. Nestas fusões, o domínio de activação transcricional das proteínas FET encontrava-se fundido ao domínio de ligação ao DNA de outro factor de transcrição. Isto levava à produção de uma proteína quimérica com função celular alterada capaz de induzir tumorigénese. Estudos mais recentes implicaram as proteínas FET em doenças neurológicas. As proteínas FET foram encontradas em inclusões citoplasmáticas de doentes com Esclerose Lateral Amiotrófica, sendo FUS a proteína mais estudada. As proteínas FET foram também associadas com a doença Degeneração Lobar Frontotemporal. Nos últimos anos, foram descobertos numerosos RNAs não codificantes denominados pequenos RNAs (small RNAs). Entre estes, os miRNAs são o grupo mais estudado, tendo-se revelado importantes reguladores da expressão génica a nível pós-transcricional. Estes, em conjunto com o Complexo de Indução do Silenciamento de RNA (RISC), despoletam a clivagem ou o silenciamento da tradução de mRNAs com os quais são complementares. A regulação exercida pelos miRNAs é muito ampla, abrangendo a maioria dos processos celulares. Assim, os miRNAs revelaram ter um papel importante na diferenciação celular e embriogénese, estando a sua expressão frequentemente desregulada em doença. O principal objectivo deste trabalho foi esclarecer se as proteínas EWS e FUS participavam na regulação da expressão de miRNAs. Experiências de imunoprecipitação da cromatina realizadas anteriormente na nossa equipa demonstraram que as proteínas EWS e FUS se encontravam ligadas em várias regiões genómicas, apresentando uma tendência para se ligar em conjunto e na região 3’ dos genes. Nos loci identificados estavam genes que codificavam miRNAs, entre eles o locus de HNRNPK (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K) onde o percursor pre-miR-7-1 é produzido para originar o miR-7. Além disso, o último exão do mRNA de hnRNPK contém um local de splicing alternativo, onde existem dois receptores de splicing, o proximal e o distal, que originam duas isoformas proteicas de hnRNPK. O presente estudo focou-se então neste locus já que apresentava a possibilidade de investigar a influência das proteínas EWS e FUS no processamento de miRNAs assim como no splicing geral e alternativo do mRNA de hnRNPK. Para estudar a função das proteínas EWS e FUS realizámos uma dupla transfecção transiente de células HEK293 com pequenos RNAs de interferência (siRNA) de modo a inibir a expressão de ambas as proteínas. Foram feitos três tratamentos: (a) inibição de EWS (KOEWS), (b) inibição de FUS (KOFUS) e (c) inibição simultânea de EWS e FUS (KOEWS+FUS). As sequências dos siRNAs usados estão descritas na Supplementary Table 1. Para a inibição de cada proteína foi usada uma mistura de dois siRNAs. Como controlo, as células HEK293 foram transfectadas com um siRNA sem quaisquer mRNAs-alvo. Procedeu-se então à quantificação da expressão do miR-7, que se apresentou sobreexpresso nos tratamentos com KOEWS e KOEWS+FUS, em comparação com KOFUS e controlo. Quantificámos também o mRNA da proteína BCL2, um alvo bona fide do miR-7. De acordo com o esperado, verificou-se uma diminuição da expressão do mRNA de BCL2 nas células em que o miR-7 estava sobreexpresso. Seguidamente, desenharam-se vários conjuntos de primers para amplificar diferentes regiões ao longo do mRNA de hnRNPK de forma a perceber se a repressão de EWS, FUS, ou ambas afectaria o splicing. De facto, nos tratamentos com KOFUS e KOEWS+FUS, verificou-se uma acumulação de mRNA não processado (unspliced mRNA), na região 3’ do mRNA de hnRNPK. No entanto, identificou-se também que as células onde a proteína EWS estava inibida (KOEWS e KOEWS+FUS) se dividiam menos e apresentavam alterações morfológicas em comparação com os restantes tratamentos. Experiências adicionais mostraram que a proteína TAF15 estava inibida nos tratamentos com KOEWS e KOEWS+FUS devido a efeitos off-target dos siRNAs usados na repressão de EWS. Assim, substituíram-se estes siRNAs por um novo siRNA sem complementaridade com TAF15 (Supplementary Table 1). Procedemos então à repetição das experiências de dupla transfecção com um novo siRNA para a inibição de EWS, realizando os seguintes tratamentos: KOEWS, KOFUS e KOEWS+FUS. Ao quantificar o miR-7 nas novas amostras, observou-se um aumento de expressão (~ 50%) apenas no tratamento KOEWS+FUS. Além disso, não se verificou repressão do mRNA de BCL2 no mesmo tratamento. De forma a esclarecer se EWS ou FUS estavam a afectar o processamento dos percursores do miR-7, pri-miR-7-1 e pre-miR-7-1, procedeu-se à quantificação dos mesmos. Ao contrário do que seria esperado, observámos que a expressão de pri-miR-7-1 encontrava-se diminuída nas células KOFUS, enquanto nos restantes tratamentos específicos não ocorreu qualquer alteração dos níveis de expressão do pri-miR-7-1. Além disso, a expressão do pre-miR-7-1 não sofreu qualquer variação. Seguidamente, foi quantificada a expressão do mRNA de hnRNPK usando conjuntos de primers acima mencionados. Os resultados obtidos foram semelhantes aos anteriores: verificou-se uma acumulação significativa de mRNA não processado na região 3’ do mRNA de hnRNPK com os tratamentos KOFUS e KOEWS+FUS, quando comparados com o controlo. Realizou-se também um ensaio para averiguar se as proteínas EWS e FUS afectavam o splicing alternativo no último exão do mRNA de hnRNPK. Para isso, desenhou-se um grupo de primers que permitiam a amplificação de duas bandas com dimensões distintas, correspondentes aos transcritos derivados do receptor de splicing proximal ou distal. Verificou-se que nas células controlo (tratadas com siRNA não específico, i. e., sem mRNAs-alvo) o receptor de splicing proximal era preferencialmente usado. No entanto, nas amostras em que as proteínas EWS, FUS ou ambas se encontravam inibidas, especialmente com KOFUS, ocorreu uma diminuição no uso do receptor de splicing proximal e um aumento no uso do receptor de splicing distal. Finalmente procedeu-se ao estudo da influência da inibição das proteínas EWS e FUS na produção da variante do mRNA de hnRNPK a partir do exão não-codificante alternativo presente na região a 5’ do mRNA de hnRNPK. Observou-se que a inibição da proteína FUS provocou um aumento da variante do mRNA de hnRNPK correspondente ao exão alternativo. Considerando os resultados obtidos, as proteínas EWS e FUS parecem regular a produção do miR-7 e o splicing do mRNA de hnRNPK. A proteína FUS aparenta inibir a produção de miR-7 a dois níveis: primeiramente, impedindo a clivagem do pri-miR-7-1 pela enzima Drosha no núcleo, e posteriormente reprimindo o processamento do pre-miR-7-1 pela enzima Dicer no citoplasma, com a ajuda da proteína EWS. Para além disso, as proteínas EWS e FUS influenciam o processamento do mRNA de hnRNPK na região 3’ assim como a escolha do receptor de splicing alternativo usado. Novamente, a proteína FUS parece ter um papel predominante, sendo que a inibição da proteína EWS não evidenciou efeitos relevantes. A região 3’ do mRNA de hnRNPK contém um local de splicing alternativo e um intrão codificante para um miRNA que são processados por maquinarias celulares distintas, nomeadamente da transcrição, do splicing e do processamento de miRNAs. Estudos anteriores mostraram que estas se influenciam mutuamente e estão estreitamente interligadas. Desta forma, é provável que os diversos processos a ocorrer neste local estejam a ser regulados por proteínas que os integram e coordenam. Considerando a presença das proteínas EWS e FUS na região a 3’ do DNA de HNRNPK e a sua capacidade de se ligar a RNAs, é possível que estas funcionem como coordenadoras dos processos celulares a ocorrer na região a 3’ do mRNA de hnRNPK.
EWS and FUS proteins belong to the FET protein family, which has been implicated in cancer and neurological diseases. Their distinct DNA and RNA binding properties and their broad spectrum of protein interactions allow them to participate in various cellular processes. So far, they have been implicated in transcription, splicing, DNA repair, mRNA transport and nucleo-cytoplasmic shuttling. They have also been found in the same complex as Drosha, indicating a role in microRNA processing that has not yet been clarified. Over the past years, microRNAs have emerged as key posttranscriptional regulators, being able to influence most cellular pathways by fine-tuning and buffering internal variations. Accordingly, microRNAs have been implicated in cell differentiation and development and often appear deregulated in human pathologies. The aim of this study was to clarify the role of EWS and FUS in microRNA function. We focused on HNRNPK locus, one of the production sites of miR-7, since EWS and FUS were found to bind to the DNA at the 3’ end of HNRNPK. siRNA-mediated depletion of EWS and FUS indicates that both proteins have a role in miR-7 processing. FUS inhibits pri-miR-7-1 cleavage by Drosha, in the nucleus, and together with EWS is able to further hinder pre-miR-7-1 Dicer cleavage, in the cytoplasm. Moreover, both proteins are able to influence alternative splice acceptor site usage at the 3’ end of hnRNPK mRNA as well as to regulate splicing in this region. Overall, FUS appears to be the main regulator whereas EWS has a supplementary role. The proposed hypothesis is that FUS, with the help of EWS, is possibly coordinating transcription, splicing and microRNA processing at the 3’ end of hnRNPK mRNA.
