Author(s): Dinis, Ana Mafalda Rodrigues, 1966-
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/8302
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Iridovírus; Proteínas; Anfíbios; Aquacultura; Parque Natural da Peneda-Gerês; Teses de mestrado - 2012
Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
O género Ranavirus é um dos principais envolvidos em episódios de alta mortalidade em explorações de aquacultura e nos casos de mortalidade espontânea em massa de anfíbios selvagens, tendo causado declínio de populações nativas de rãs, sapos e salamandras, em vários pontos do planeta. Tem sido reconhecida a importância do estudo e caracterização destes vírus, com o propósito de compreender melhor estes surtos infecciosos e poder contribuir para a diminuição da incidência de doenças provocadas pelos mesmos, minimizando assim problemas ecológicos e problemas económicos especialmente quando estes surtos atingem espécies de valor comercial como as espécies de aquacultura. O presente trabalho teve como objectivo proceder à caracterização geral de iridovírus isolados de duas espécies de tritões (Triturus marmuratus e Triturus boscai) do Parque Natural da Peneda-Gerês, por comparação com um outro vírus isolado de um réptil (Lacerta monticula) da Serra da Estrela e com o vírus protótipo desta família, o Frog vírus 3 (FV-3). As condições de propagação e produção dos isolados virais em estudo foram optimizadas conseguindo-se a implementação da replicação destes vírus em células VERO cultivadas num meio independente de CO2. Nestas condições laboratoriais foram efectuadas cinéticas de replicação destes vírus, que permitiram agrupar os vírus em estudo. Os vírus isolados de tritões constituíram um grupo com cinéticas sobreponíveis, distintas das do FV3 e do vírus isolado da L. monticola, ambos com cinéticas semelhantes. Sequenciaram-se produtos de PCR correspondentes a regiões conservadas (sequências parciais das regiões MCP e Pol) obtendo-se uma total identidade entre as sequências dos isolados dos tritões, e uma identidade elevada com sequências publicadas de numerosos isolados do género Ranavirus, entre elas as do FV3 e do vírus isolado da L. monticula, relativamente às quais apresentaram identidades de 98%. Foi ainda possível identificar estes isolados como pertencentes ao género Ranavirus pelo efeito citopático (CPE) típico produzido em culturas celulares e pelo padrão de metilação do DNA viral. De todos os métodos testados, a abordagem mais eficaz para distinguir os diferentes isolados foi a análise electroforética das proteínas dos virões destes isolados, em que se observaram padrões semelhantes, mas não idênticos. No entanto, o elevado grau de semelhança corrobora os resultados obtidos com a análise dos genomas destes vírus.
Ranavirus is one of the genus most involved in episodes of high mortality in aquaculture farms and in cases of spontaneous mass mortality of wild amphibians, having caused decline of native populations of frogs, toads and salamanders at various points of the planet. It has been recognized the importance of the study and characterization of these viruses, in order to better understand these outbreaks and be capable of contributing for the reduction of the incidence of diseases caused by them; this will allow to minimize ecological and economic problems, especially when concerning outbreaks affecting commercially valuable species, as aquaculture species. This study aimed to characterize iridovirus isolated from two species of newts (Triturus marmuratus e Triturus boscai) of the Portuguese Natural Park of Peneda-Gerês, by comparison with another virus isolated from a reptile (Lacerta monticula) from Serra da Estrela and the prototype virus of the Ranavirus genus and Iridoviridae family, Frog virus 3 (FV3). The conditions of propagation and production of the virus isolates under study were optimized, affording implementing their replication in VERO cells grown in CO2 independent medium. Under these laboratory conditions kinetics of virus replication were performed which allowed grouping the virus under study. Viruses isolated from newts formed a group with overlapping kinetics, distinct from FV3 and the virus isolated from L. monticola, both with similar kinetics. PCR products from conserved regions (partial sequences of MCP and Pol regions) were sequenced, showing a total identity among the sequences of the isolates of newts and a high identity with published sequences of numerous isolates from the Ranavirus genus, including those of FV3 and the virus isolated from L. monticula, with which showed 98% identity. It was also possible to identify these isolates as belonging to the Ranavirus genus by the typical cytopathic effect (CPE) produced in cell cultures and by the methylation status of the viral DNA. Of all the methods tested, the most effective approach to distinguish different isolates was the electrophoretic analysis of virions proteins which showed similar patterns, but not identical. However, this high degree of similarity confirms the high identity obtained by the analysis of these viruses genomes.
