Author(s): Rodrigues, Alexandre Miguel Cavaco, 1983-
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/8626
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Xenopus laevis; Zebrafish; Regeneration; Cell dedifferentiation; Skeletal muscle; Teses de doutoramento - 2013
Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013
Humans, as every mammalian animal, have a limited capacity to repair or regenerate damaged body parts. In contrast, certain amphibian species possess extraordinary regenerative capacities that, for example, allow them to reform severed appendages such as limbs and tails. The phenomenon of appendage regeneration in vertebrate animals, formally called epimorphic regeneration, has attracted the attention of scientists for centuries. Understanding which factors are behind the capacity to restore a lost or severely injured body part in animal models has obvious implications to human health. Cellular, genetic or chemical therapies are some of the procedures that already are or may soon be applied to human patients to ameliorate conditions related to diseased, injured or lost body structures. An immense research effort has been made into uncovering the molecular and cellular differences between lower, regenerating vertebrates, and the non-regenerating, higher vertebrates. One of the main differences resides in the formation of the blastema, a specialized structure at the tip of the stump that will grow in size and reform the lost appendage. This structure contains highly proliferative stem-like cells that migrated from the tissues in the distal part of the stump. Mammals generally fail to form a blastema, while in most amphibians and fish, a blastema starts to form right after wound healing. The process of blastema formation relies on the activation of adult stem cells and, in most cases, in the dedifferentiation of mature cells. Cellular dedifferentiation is characterized by the loss of differentiation or specialization characteristics and by the acquisition of stem cell features such as proliferation and migration. In short, differentiated cells return to a stem-like state, what gives them the capacity to contribute to the blastema. The presence of stem cells in a tissue and/or the ability to dedifferentiate mature cells is generally associated with the capacity to regenerate. Skin, bone and skeletal muscle tissues can regenerate independently (to some extent) in mammalian animals because these tissues possess a population of adult stem cells that proliferates and substitutes the damaged cells in each tissue. On the other hand, a severed limb does not regenerate, although it is mainly formed by these same tissues. Several scientists believe that mammals and many other animals do not undergo epimorphic regeneration because their cells do not have the capacity to dedifferentiate in vivo, failing thus to form a blastema. Accordingly, various studies have shown that mammalian cells in culture are much harder to dedifferentiate than amphibian cells, but still do, what indicates that it could be possible to induce dedifferentiation in mammalians and, maybe, stimulate limb regeneration in the process. In this thesis I studied the phenomenon of epimorphic regeneration in two species of aquatic animals, the frog Xenopus laevis and the “zebrafish” Danio rerio. I focused on the detection of dedifferentiation in Xenopus and zebrafish, and on the possibility to enhance Xenopus limb regeneration through the induction of dedifferentiation. The choice to work with Xenopus was based on the fact that Xenopus larvae (tadpoles) gradually lose the capacity to regenerate their limbs during larval development and metamorphosis, in a somewhat analogous way to what happens in mammalian embryos during gestation. Moreover, Xenopus and mammals apparently share the incapacity to induce dedifferentiation during regeneration. This puts Xenopus laevis closer to mammalian animals in respect to the regenerative capacity, making it a very interesting choice to study and test ways to improve the regenerative capacity in mammals. On the other hand, zebrafish was studied because this animal model allows the quick creation of transgenic lines and, at the same time, it has a great regenerative ability. Since one of the main tissues contributing to limb or tail blastemas is the skeletal muscle, I centred most effort on the study of this tissue. Skeletal muscle is mainly composed of elongated cells called muscle fibres, or myofibres, that form during development and regeneration by the fusion of multiple myogenic progenitor cells known as myoblasts. For this reason, myofibres are multinucleated, or syncytial, cells. Muscle fibres are also characterized by a highly organized internal structure, necessary for proper contraction of the muscle. Microscopically, this complex internal structure is built up by aligned proteins that create the characteristic striated pattern of the muscle. Early studies in urodele amphibians (salamanders, the “champions” of regeneration) showed that the striated pattern of limb muscle is lost during early stages of regeneration, an indicative feature of muscle dedifferentiation. Further studies strongly suggested that limb and tail muscle fibres were able to fragment and that the resulting mononuclear cells proliferated and contributed to the blastema. Along with the described muscle dedifferentiation, also muscle stem cells (satellite cells) were recently shown to contribute to the new muscle during regeneration. In contrast to what is described in urodeles, recent studies on Xenopus tail regeneration revealed that muscle fibres do not contribute to the blastema, strongly suggesting the absence of muscle dedifferentiation. Instead, muscle satellite cells were shown to be the main contributor to the new tail muscle. The absence of dedifferentiation during Xenopus regeneration could explain why these animals gradually lose their limb regenerative capacity while limb cells differentiate. In my thesis I examined the relation between dedifferentiation and regenerative capacity of Xenopus, dividing this study in two main projects. The first project was intended to confirm if dedifferentiation was in fact absent from limb regeneration, through the use of diverse assessment techniques. In the second project I tested several methods expected to induce dedifferentiation and, possibly also, to enhance limb regeneration. To confirm the absence of (muscle) dedifferentiation during limb regeneration I tested different cell labelling techniques to trace muscle fibres during regeneration (the best technique would be also used for the second project), analysed the ultrastructure of regenerating limbs, and measured the expression levels of some muscle specific genes. Although no cell labelling technique worked well enough to confirm the absence of dedifferentiation, histological and gene expression analysis showed no clear evidences of limb muscle dedifferentiation. On the other hand, tail muscle regeneration, which was initially meant to serve only as a negative control for dedifferentiation, surprisingly revealed dedifferentiation phenotypes both histologically and by gene expression analysis. Nevertheless, I concluded that this dedifferentiation was incomplete since it neither resulted in the cell cycle re-entry of myonuclei nor in the fragmentation of labelled muscle fibres. Consequently, no labelled myofibres contributed with nuclei to the regenerated tail muscle. Similar observations were made in the tail of zebrafish larvae. Labelled muscle fibres did not contribute to the regenerated muscle and, on contrary to tadpole tail, no signs of histological dedifferentiation were found. The complete absence of dedifferentiation on zebrafish tail muscle revealed that skeletal muscle dedifferentiation is less common than previously expected in lower vertebrates. The in vivo tracing of labelled muscle fibres in the tadpole tail also evidenced a relation between the histological dedifferentiation phenotype and the retraction of muscle fibres upon amputation. Both phenotypes were mostly present in a specific type of muscle fibre and after amputation at a certain level, shared similar myofibre shapes or morphologies, and gradually disappeared with time. Importantly, the absence of both phenotypes in a more proximal level of amputation indicates that the observed “incomplete” dedifferentiation is not necessary for muscle regeneration. In addition, the apparent cause-effect relation between retraction and dedifferentiation suggests that dedifferentiation is a stress- or damage-related response and, not necessarily, regeneration-related. In the second project I investigated the possibility to stimulate Xenopus limb regeneration through the induction of dedifferentiation. This idea was not new and had previously given few positive results, although no clear proof of dedifferentiation induction was presented. I tested various strategies, from chemical treatments to transgene overexpression, but they were mostly unsuccessful. A few treatments showed a tendency to improve limb regeneration but I was not able to verify if dedifferentiation was indeed induced, since the cell labelling techniques from the first project were ineffective in the limbs. In a complementary study I analysed the expression pattern of bmp2, 4 and 7 genes during limb development and regeneration and found a clear relation between bmp expression and successful regeneration.
Os humanos, como qualquer mamífero, têm uma capacidade limitada para reparar ou regenerar partes do corpo danificadas. Por outro lado, certas espécies de anfíbios possuem extraordinárias capacidades regenerativas já que, por exemplo, conseguem regenerar membros amputados completamente. O fenómeno de regeneração de apêndices (membros e caudas) em animais vertebrados, formalmente denominado de regeneração epimórfica, tem atraído a atenção dos cientistas desde há séculos. Compreender quais os fatores que estão por detrás da capacidade de restaurar uma parte do corpo perdida ou gravemente danificada tem óbvias implicações para a saúde humana. Terapias celulares, genéticas ou químicas são alguns dos procedimentos que já são, ou podem rapidamente vir a ser, aplicados a pacientes humanos para tratar problemas de saúde relacionados com estruturas do corpo doentes, danificadas ou perdidas. Um imenso esforço tem sido feito para descobrir as diferenças entre os vertebrados “inferiores” que regeneram epimórficamente e os vertebrados “superiores”, que basicamente não regeneram. Uma das principais diferenças reside na formação do blastema, uma estrutura especializada na ponta do coto, que crescera em tamanho e reformara as estruturas perdidas pela amputação. O blastema contém células semelhantes às estaminais, altamente proliferativas, que migraram dos tecidos da parte distal do apêndice amputado. Os mamíferos, geralmente não conseguem formar um blastema, enquanto que na maioria dos anfíbios e peixes, o blastema começa a formar-se pouco tempo depois da amputação. O processo de formação do blastema depende da activação de células estaminais adultas e, na maioria dos casos, na desdiferenciação de células maduras. A desdiferenciação celular caracteriza-se pela perda de características de diferenciação ou especialização e pela aquisição de características de células estaminais, como a proliferação e migração. Em suma, as células diferenciadas retornam a um estado estaminal, o que, aparentemente, lhes dá a capacidade de contribuir para o blastema. A presença de células estaminais nos tecidos e/ou a capacidade das células maduras de se desdiferenciarem, está geralmente associada a capacidade regenerativa. A pele, os ossos e os músculos esqueléticos podem regenerar de forma independente, embora limitada, em mamíferos, porque esses tecidos possuem uma população de células estaminais adultas que prolifera e substitui as células danificadas de cada tecido. Por outro lado, um membro amputado não se regenera nos mamíferos, embora este seja, principalmente, formado pelos tecidos anteriormente referidos. Vários cientistas afirmam que os mamíferos e outros animais não regeneram epimórficamente porque as suas células não possuem a capacidade de se desdiferenciar in vivo, o que impossibilitaria a formacao do blastema. Para além disso, vários estudos tem demonstrado que as células de mamíferos em cultura são muito mais difíceis de desdiferenciar do que as células de anfíbios, mas, ainda assim, conseguem faze-lo. Isto indica que poderia ser possível induzir a desdiferenciação em mamíferos e, indirectamente, estimular a capacidade regenerativa. Nesta tese estudei o processo de regeneração epimórfica em duas espécies de animais aquáticos, a rã Xenopus laevis e o "peixe-zebra" Danio rerio. Centrei-me na deteção de desdiferenciação em Xenopus e peixe-zebra, e na possibilidade de melhorar a capacidade regenerativa das patas de Xenopus através da indução de desdiferenciação. Escolhi trabalhar com Xenopus pelo facto de que as suas larvas (girinos) perderem gradualmente a capacidade de regenerar os membros inferiores durante o desenvolvimento larval e metamorfose, de uma maneira análoga ao que acontece em embriões de mamíferos durante a gestação. Para além disso, Xenopus e mamíferos aparentemente partilham a incapacidade de induzir a desdiferenciação durante a regeneração. Isto coloca a Xenopus laevis cerca dos mamíferos no que se refere a capacidade de regeneração, tornando-a numa escolha muito interessante para estudar e testar formas de melhorar a capacidade de regeneração em mamíferos. Por outro lado, trabalhei também com o peixe-zebra porque este modelo animal permite a rápida criação de linhas transgénicas e, ao mesmo tempo, tem uma elevada capacidade regenerativa. Uma vez que um dos tecidos que mais contribui para os blastemas dos membros ou das caudas e o músculo esquelético, centrei a maior parte dos meus estudos neste tecido. O músculo esquelético e composto principalmente por células alongadas chamadas fibras musculares, ou miofibras, que se formam durante o desenvolvimento e regeneração através da fusão de várias células progenitoras conhecidas como mioblastos. Por esta razão, as miofibras são células multinucleadas ou sinciciais. As fibras musculares são também caracterizadas por uma estrutura interna altamente organizada, necessária para a contração do músculo. Microscopicamente, esta complexa estrutura interna é constituída por proteínas que, ao estarem perfeitamente alinhadas, criam o característico padrão estriado destes músculos. Estudos antigos em anfíbios urodelos (salamandras, os "campeões" da regeneração) demonstraram que o padrão estriado dos músculos dos membros e perdido durante as primeiras fases da regeneração, uma característica indicativa da desdiferenciação das células musculares. Estudos adicionais sugeriram que as fibras musculares dos membros e da cauda eram capazes de fragmentar-se e que as células mononucleares resultantes proliferavam e contribuíam para o blastema. Juntamente com a desdiferenciação muscular, mais recentemente foi descrito que também as células estaminais musculares (células satélite) contribuem para a regeneração dos novos músculos. Ao contrário do que e descrito nos urodelos, estudos recentes na regeneração da cauda de Xenopus revelaram que as suas fibras musculares não contribuem para o blastema, o que indica que a desdiferenciação muscular não ocorre neste animal. Em vez disso, as células satélite são o principal contribuinte para o novo músculo da cauda. A inexistência de desdiferenciação durante a regeneração em Xenopus pode explicar porquê os girinos perdem capacidade regenerativa nos membros enquanto as suas células se diferenciam. Por isso, nesta tese examinei a relação entre desdiferenciação e a capacidade regenerativa de Xenopus, dividindo este estudo em dois projetos. O primeiro foi delineado para confirmar se a desdiferenciação está, de facto, ausente durante a regeneração das patas de Xenopus, através da utilização de diversas técnicas de avaliação. No segundo testei vários métodos indutores da desdiferenciação que, possivelmente, também melhorariam a regeneração dos membros. Para confirmar a ausência de desdiferenciação (muscular) durante a regeneração dos membros de Xenopus, testei diferentes técnicas para marcar e seguir as fibras musculares durante a regeneração (a melhor técnica seria usada também no segundo projeto), analisei a ultra-estrutura dos membros amputados e medi os níveis de expressão de alguns genes específicos do músculo. Embora nenhuma técnica de marcação celular tenha funcionado bem o suficiente para confirmar a ausência de desdiferenciação nos membros, os resultados das análises histológicas e de expressão génica apontaram para a ausência de desdiferenciação muscular. Por outro lado, a regeneração do músculo da cauda, a qual foi inicialmente usada como um controlo negativo de desdiferenciação, surpreendentemente revelou fenótipos de desdiferenciação histológica e génica. No entanto, pude concluir que esta desdiferenciação era incompleta, uma vez que não resultava na ativação do ciclo celular dos mionúcleos, nem na fragmentação das fibras musculares marcadas. Por conseguinte, nenhuma miofibra marcada contribuiu com nucleos para o músculo caudal regenerado. Observações semelhantes foram feitas na cauda de larvas do peixe-zebra. As fibras musculares marcadas não contribuíram para o músculo regenerado e, ao contrário da cauda de girino, nem desdiferenciação histológica foi observada. A absoluta ausência de desdiferenciação no músculo da cauda do peixe-zebra revelou que a desdiferenciação do músculo esquelético e menos comum do que era esperado em vertebrados inferiores. O seguimento in vivo de fibras musculares marcadas na cauda de girino evidenciou também uma relação entre o fenótipo histológico de desdiferenciação e a retração das fibras musculares causada pela amputação. Ambos os fenótipos estavam geralmente presentes num determinado tipo de fibra muscular e após amputações distais. Para além disso, as miofibras afectadas partilhavam formas ou morfologias semelhantes, e ambos os fenótipos desapareceram gradualmente com o tempo. A particular ausência de ambos os fenótipos num nível de amputação mais proximal indica que a desdiferenciação “incompleta” não é necessária para a regeneração do músculo. Para além disso, a aparente relação de causa-efeito entre retração e desdiferenciação sugere que a última e uma resposta ao stress ou danos e, não necessariamente, relacionada com a regeneração epimórfica. No segundo projeto, investiguei a possibilidade de estimular a regeneração de membros de Xenopus através da indução de desdiferenciação. Esta ideia não era nova e já tinha dado alguns resultados positivos em estudos anteriores, embora nenhuma prova clara de indução de desdiferenciacão tivesse sido apresentada. Testei várias estratégias, desde tratamentos químicos a sobreexpressão génica, mas estas foram na sua grande maioria infrutíferas. Alguns tratamentos mostraram uma tendência para melhorar a regeneração dos membros, mas não me foi possível verificar se a desdiferenciação tinha sido induzida, uma vez que as técnicas de marcação celular do primeiro projeto resultaram ineficazes nos membros. Num estudo complementar investiguei o padrão de expressão dos genes bmp2, 4 e 7 durante o desenvolvimento e regeneração dos membros e encontrei uma relação clara entre a expressão de bmps e o sucesso regenerativo.
Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/29865/2006)
