Author(s): Loureiro, Cláudia Almeida
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/9263
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Cotransportadores; NKCC2; KCC3; Proteína cinase; WNK4; SYK; Fosforilação; Teses de mestrado - 2012
Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012
A hipertensão arterial afeta, em países ocidentais, quase um terço da população adulta, sendo um fator de alto risco para a doença cardiovascular ou o acidente vascular cerebral. O pseudohipoaldosteronismo tipo II, ou síndroma de Gordon, é uma forma rara de hipertensão familiar, caracterizada pela ocorrência de hipertensão acompanhada por hipercalemia, e causado por mutações nos genes WNK1 e WNK4. Os mecanismos moleculares subjacentes a esta condição envolvem a regulação da homeostase renal de eletrólitos, principalmente nos túbulos distais do nefrónio onde ocorre a modulação de diversos canais iónicos e transportadores através da cooperação das proteínas cinases WNK, como do canal de potássio ROMK e do cotransportador de sódio e cloreto NCC. A WNK1 e WNK4 ativam as cinases OSR1 e SPAK, que por sua vez fosforilam diretamente as proteínas da família SLC12 (NCC, NKCC1 e NKCC2), ativando o transporte iónico. A subfamília das proteínas cinases WNK (with-no-lysine [K]) pode regular a atividade dos vários canais iónicos envolvidos na homeostase de sódio, potássio e cloreto através da sua fosforilação como também o número de canais proteicos expressos na membrana plasmática (MP). Num estudo realizado recentemente sobre a regulação do canal de cloreto CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Condutance Regulator), verificou-se que a presença de WNK4 aumenta também a quantidade de CFTR na MP. O mecanismo é diferente e envolve um papel antagonista ao da tirosina cinase Syk (spleen tyrosine kinase), que fosforila a proteína CFTR e promove a sua remoção da MP, uma atividade inibida pela WNK4. O alvo da regulação é o resíduo tirosina 512 da CFTR, localizado num motivo de consenso da cinase Syk. Este motivo peptídico especifico foi, por sua vez encontrado na sequência primária de mais dois canais iónicos: NKCC2 e KCC3. O primeiro é um cotransportador renal de sódio, potássio e cloreto que facilita o influxo de sódio e cloreto nas células enquanto o segundo compensa com o efluxo de potássio e cloreto e tem expressão renal e neuronal. Ambos são importantes para a homeostase eletrolítica nos rins e na manutenção da tensão arterial. O presente estudo teve como objetivo verificar experimentalmente o envolvimento da via WNK4/Syk na regulação dos canais renais NKCC2 e KCC3, nomeadamente se a Syk fosforila os canais in vitro, e realizou-se em três fases. Numa primeira fase, foram analisadas as sequências dos canais renais NKCC2 e KCC3 no sentido de selecionar fragmentos dos respetivos domínios N-terminais que contêm os motivos de fosforilação pela Syk e que apresentavam uma previsão computacional de gerarem proteínas recombinantes solúveis. Estes fragmentos foram clonados no plasmídeo pET-28a e as respetivas proteínas recombinantes expressas em bactérias. Após a lise das bactérias por sonicação, verificou-se que a maioria das proteínas se encontrou na fração solúvel, confirmando experimentalmente a previsão bioinformática. De seguida, procedeu-se à purificação das proteínas recombinantes a partir do lisado bacteriano. Na segunda fase, foi avaliado em ensaios de fosforilação in vitro se os substratos recombinantes produzidos anteriormente são substratos da cinase Syk. Estes ensaios foram realizados com a cinase imunoprecipitada a partir de células HEK 293T transfectadas com os construtos Syk-wt, Syk-kd e com o vetor não recombinante. Para além dos fragmentos recombinantes das proteínas NKCC2 wt e KCC3 wt foram também utilizados os fragmentos mutantes, NKCC2 Y45F e KCC3 Y63F. Estes mutantes possuem uma substituição no resíduo de tirosina, local de fosforilação pela cinase Syk. Nestes ensaios, observou-se claramente a fosforilação dos canais renais NKCC2 wt e KCC3 wt por parte da cinase Syk-wt. Para além disso, observou-se também uma fosforilação residual dos canais mutantes pela Syk-wt. Numa terceira fase, identificou-se a expressão da proteína NKCC2 endógena numa linha celular renal, indicando assim um modelo celular para o estudo do canal in vivo. Esta fase tem como objetivo determinar o efeito que a transfecção de células renais com Syk e WNK4 terá sobre a quantidade na membrana plasmática dos dois canais renais em estudo. O presente trabalho contribuiu para a compreensão da regulação dos referidos canais iónicos a partir da via Syk/WNK4. A validação da fosforilação dos dois canais justifica agora um estudo mais alargado que visa caracterizar mais um modo de atuação de WNK4 sobre a homeostase eletrolítica nos rins, como também a contribuição desta via para a hipertensão. Assim, este estudo poderá identificar novos alvos terapêuticos no tratamento da hipertensão arterial.
Arterial hypertension affects one third of the Western population and constitutes a remarkable risk factor for cardiovascular disease and stroke. Pseudohypoaldosteronism type II or Gordon's syndrome is a rare familial form of hypertension characterized by increased renal salt reabsorption accompanied by hyperkalemia, and caused by mutations in the WNK1 and WNK4 genes. These encode protein kinases regulating renal electrolyte homeostasis through modulation of several membrane transporters and ion channels. In a recent study on the regulation of the chloride channel CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator Condutance), the presence of WNK4 was described to increase the amount of CFTR at the cell surface. The underlying mechanism involves tyrosine kinase Syk (Spleen tyrosine kinase), that phosphorylates CFTR protein and promotes its removal from the plasma membrane being this activity inhibited by WNK4. The target residue is CFTR tyrosine 512, located in a Syk-consensus motif. Thus, the WNK4/Syk interplay identified may also operate in the regulation of other chloride cotransporters that contain this consensus motif. Among different transport proteins, this motif was identified in the sequence of two ion channels, NKCC2 and KCC3, which are important for electrolyte homeostasis in the kidney and blood pressure regulation. The goal of this work was to assess experimentally whether the WNK4/Syk pathway could be involved in the regulation of renal channels NKCC2 and KCC3, particularly if Syk can phosphorylate these channels in vitro. In order to achieve this, NKCC2 and KCC3 peptide sequences were first analysed with the objective of selecting fragments that contain the recognition motifs of Syk and that have a computational prediction of generating recombinant soluble proteins. Then, the recombinant proteins were expressed in bacteria, which were lysed by sonication and the soluble fraction purified. Subsequently, the recombinant substrates produced above were tested in in vitro phosphorylation assays and a strong phosphorylation of renal channels NKCC2 wt and KCC3 wt by Syk was observed. Finally, expression of the endogenous NKCC2 protein was identified in a renal cell line, suggesting that this line can be a suitable model for studying the effect of channel phosphorylation in vivo. The results of this study contribute to understand the regulation of ion channels via the WNK4/Syk pathway and a new mode of operation of WNK4 in the regulation of electrolyte homeostasis in the kidney, related to hypertension.
