Interactions of HIV fusion inhibitors with biomembranes model systems and human blood cells

• Author(s): Augusto, Marcelo Alexandre da Costa Tavares
• Date: 2013
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/9564
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Bioquímica; Teses de mestrado - 2013
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Santos, Nuno Cardoso, 1974-; Coutinho, Ana Isabel Abrantes, 1965-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013

O Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) é uma das doenças infecciosas mais sérias que tem afetado a humanidade, cujo agente causador é o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Em geral, o sistema imunitário fica enfraquecido, levando a um aumento da suscetibilidade dos pacientes a infeções de baixa gravidade na ausência da imunossupressão, bem como tumores que normalmente não afetam indivíduos saudáveis. Existem dois tipos de HIV, sendo o vírus do tipo 1 (HIV-1) o mais virulento e o responsável pela presente pandemia. Segundo o último relatório do Programa para a SIDA das Nações Unidas (UNAIDS), em 2011, 34 milhões de pessoas estavam infetadas com HIV e cerca de 1,7 milhões de pessoas morreram com SIDA. O HIV originou-se a partir de múltiplas transmissões zoonóticas do vírus da imunodeficiência símia (SIV) proveniente de primatas não-humanos para seres humanos, na África Ocidental e Central. Devido à elevada variabilidade genética que o HIV possui, existem atualmente vários subtipos e várias formas recombinantes que são responsáveis pela transmissão do vírus entre humanos. O HIV-1 é um retrovírus constituído por um envelope lipídico derivado da membrana plasmática da célula hospedeira. Em termos de composição da membrana viral, esta possui proteínas envolvidas no processo de entrada do vírus na célula alvo. O complexo glicoproteico gp120-gp41 é o responsável pela iniciação do processo de infeção da célula hospedeira. Mais especificamente, a gp120 tem como função a ligação do virião à célula alvo (maioritariamente linfócitos T) via recetor CD4, enquanto a gp41 é a subunidade proteica responsável pelo processo de fusão entre a membrana viral e a membrana da célula hospedeira. A inibição da replicação do vírus por uso dos agentes antirretrovirais clássicos, cujo alvo são 3 enzimas do ciclo replicativo (transcriptase reversa, integrase e protease), tem levado à geração de estirpes de vírus resistentes aos fármacos. Para além disso, estes antirretrovirais apenas atuam após o genoma viral ter entrado na célula. De modo a ultrapassar estes problemas, foram desenvolvidas moléculas que têm como função inibir o processo de entrada do vírus na célula alvo, mais especificamente, o processo de fusão membranar mediado pela proteína gp41. Estas moléculas são designadas por inibidores de fusão (FIs), existindo atualmente várias classes consoante o seu alvo molecular. Visto que as proteínas necessárias ao processo de fusão estão em contacto com membranas, a eficácia dos FIs também está relacionada com a afinidade destes para com as membranas. Este facto reitera a importância das membranas como fator essencial para um possível aumento da concentração local dos FIs junto do seu alvo molecular. Nesta dissertação foram estudados vários inibidores de fusão do HIV-1, com o objetivo de avaliar a interação dos mesmos com sistemas modelo de biomembranas e igualmente com as membranas de algumas células do sangue, nomeadamente linfócitos e eritrócitos. Os inibidores de fusão estudados são de origem peptídica e foram desenhados a partir da região CHR da proteína gp41, que está envolvida no processo de fusão membranar. Todos os péptidos derivados dessa região são designados por péptidos C ou por inibidores de fusão classe I, tendo como alvo molecular a região NHR da proteína gp41. Portanto, o que estes inibidores fazem é mimetizarem a região CHR e intrometerem-se na ligação destas duas regiões (CHR-NHR) e impedirem que ocorra a fusão entre o vírus e a célula alvo. O péptido inibidor de fusão que está na base dos estudos aqui apresentados é o C34. Possui 34 resíduos de aminoácidos, e apresenta atividade antiviral. No terminal amina deste péptido está presente o pocket-binding domain (PBD), importante para a ligação à região NHR, mas o terminal carboxilo não possui o lipid-binding domain (LBD) que muitos outros C péptidos possuem para conseguirem interagir com membranas. Apesar de não possuir o LBD, este péptido possui uma alta atividade antiviral, e tem sido usado como modelo para a geração de novos inibidores de fusão. A conjugação de um domínio de colesterol ao terminal carboxilo do péptido C34 levou a um aumento considerável da atividade antiviral por parte do novo inibidor de fusão, C34-colesterol. Combinando dimerização, colesterol e adição de unidades de polietilenoglicol (PEG) originaram-se mais dois novos derivados do C34. Um dos derivados de péptidos é muito semelhante ao C34-colesterol, onde apenas foi adicionado um espaçador de polietilenoglicol (PEG) entre o colesterol e o péptido, dando origem ao HIVP3 (C34-PEG4-colesterol). O outro inibidor é um dímero deste último composto, [C34-PEG4]2-colesterol, e designa-se HIVP4. Tanto o HIVP3 como o HIVP4 apresentam uma atividade antiviral melhorada relativamente ao C34-colesterol, para além de um elevado tempo de semivida em circulação. Como controlo foi desenhado o péptido HIVP5, [C34-PEG11]2, um análogo do HIVP4, mas sem o domínio de colesterol. Recorrendo a lipossomas marcados com uma sonda fluorescente sensível ao potencial de dipolo da membrana, di-8-ANEPPS, concluiu-se que o C34-colesterol apresenta uma maior interação com membranas que contêm uma elevada percentagem de colesterol. Quanto ao péptido não conjugado, C34, este não tem tendência para interatuar com membranas. Estes resultados foram incluídos num artigo publicado na revista PLoS One (doi:10.1371/journal.pone.0060302). Relativamente aos compostos HIVP3, HIVP4 e HIVP5, o objetivo foi estudar a interação destes compostos com sistemas modelo de biomembranas e com células do sangue humano, nomeadamente linfócitos e eritrócitos. Devido à presença de resíduos de triptofano na sequência de aminoácidos destes péptidos, foi possível estudar a sua partição com vesículas lipídicas (lipossomas) de composição variável. Através da excitação seletiva dos resíduos de triptofano, e deteção da emissão de fluorescência dos mesmos, concluiu-se que tanto o HIVP3 como o HIVP4 particionam preferencialmente para vesículas lipídicas ricas em colesterol. Por outro lado, o controlo HIVP5 não particiona para membranas, tal como no caso do C34. Por comparação dos valores da constante de partição dos novos péptidos com os do C34-colesterol, propusemos que a presença de PEG pode estar a influenciar a menor inserção dos resíduos de triptofano na membrana observada para o HIVP3 e HIVP4. De seguida, medindo as alterações na pressão superficial que os compostos induzem numa monocamada lipídica, concluiu-se que o HIVP4 tem uma maior afinidade para as monocamadas relativamente ao HIVP3. Para além disso, o HIVP4 apresenta uma cinética de inserção mais rápida que o HIVP3. Com estes resultados, concluímos que a dimerização presente no HIVP4 influencia a cinética e a afinidade do péptido para estes sistemas lipídicos. Quanto à localização dos péptidos na bicamada lipídica, recorrendo a experiências de extinção de fluorescência em solução aquosa e em membrana, concluímos que tanto o HIVP3 como o HIVP4 apresentam os seus resíduos de triptofano muito expostos ao ambiente aquoso, o que nos permite concluir e explicar os baixos valores de partição e a menor afinidade para membranas. Apesar de os péptidos interagirem menos com as membranas através dos seus resíduos de triptofano, a presença de colesterol poderá permitir ao inibidor de fusão uma interação forte com a membrana através deste domínio. Com recurso a lipossomas marcados com uma sonda fluorescente sensível ao potencial de dipolo, di-8-ANEPPS, concluímos que os compostos HIVP3 e HIVP4 interagem preferencialmente com membranas com alto conteúdo em colesterol. Mais especificamente, a maior interação foi observada para a composição lipídica que mimetiza as jangadas lipídicas, onde se sabe que estão presentes os recetores envolvidos na fusão viral. Em relação à interação com linfócitos e eritrócitos, usando a marcação das membranas com di8-ANEPPs, concluímos que o HIVP4 interage mais com linfócitos do que o HIVP3. Quanto aos eritrócitos, ambos os péptidos apresentam uma interação semelhante. Em resumo, tanto o HIVP3 como HIVP4 apresentam uma menor partição, afinidade e uma localização mais superficial na bicamada lipídica comparativamente ao C34-colesterol. A presença de um espaçador de PEG e a dimerização são determinantes para explicar os resultados observados. O espaçador permite um maior afastamento entre o domínio de colesterol e o péptido, o que pode explicar a menor interação com as membranas observada ao nível dos resíduos de triptofano. Por outro lado, a dimerização pode ser fundamental ao influenciar a concentração do péptido ao nível da membrana. A presença do domínio de colesterol é necessária para a interação dos péptidos com a membrana, especialmente em composições lipídicas ricas em colesterol.

Viral fusion inhibitors are designed to block the fusion between the membranes of an enveloped virus and a target cell, therefore preventing the entrance of the viral content. Recently, the conjugation of cholesterol to a HIV-1 fusion inhibitor peptide, C34, resulted in an increase of the antiviral potency of the conjugated peptide (C34–cholesterol). Moreover, the combination of cholesterol-tagging, using a PEG moiety as spacer, and dimerization of the C34 peptide sequence, improved the antiviral potency and extended the in vivo half-life of two new HIV fusion inhibitors: HIVP3 (C34–PEG4–cholesterol) and HIVP4 ([C34–PEG4]2–cholesterol). The aim of the present work was to evaluate the interaction of these molecules with membrane model systems and human blood cells, in order to clarify their mechanism of action at the molecular level. The first tagged-generation peptide, C34-cholesterol, interacts preferential with cholesterol-rich membranes, while C34 alone does not. The new generation of tagged peptides, HIVP3 and HIVP4, has also a preference for cholesterol-rich liquid ordered membranes, especially membranes that mimic biological microdomains known as lipid rafts. Regarding the human erythrocytes and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), HIVP3 and HIVP4 are able to interact with both blood cells to a similar degree as C34–cholesterol. However, the pocket binding domain (PBD) on HIVP3 and HIVP4 is more exposed to the aqueous environment than on C34–cholesterol. The present data indicate that the more efficient blocking of HIV entry results from the synergic effect between the membranotropic behavior promoted by the cholesterol moiety and the enhanced exposure of the PBD associated to the PEG spacer.