Caracterização de populações de castanheiro (Castanea spp.) resistentes e susceptíveis à doença da tinta : uma abordagem polifásica

• Author(s): Anjos, Maria do Rosário Alves Ferreira dos
• Date: 2003
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10348/11
• Origin: Repositório da UTAD
• Subject(s): Castanea sativa; Castanheiro; Variação genética; Marcadores genéticos
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: Portuguese

Description

O castanheiro europeu (Castanea sativa Mill) é uma espécie economicamente importante e por isso o seu cultivo tem induzido a perda de variabilidade genética, resultando num aumento de sensibilidade dos povoamentos aos fungos responsáveis por doenças como, por exemplo, a doença da tinta. A presente tese pretende contribuir para alargar o conhecimento acerca da variabilidade genética de populações de castanheiro Castanea spp, dedicando-se o capítulo 1 a uma descrição do estado actual do conhecimento da espécie e que engloba a sua origem, características botânicas e ecológico-culturais, patologia e alguns aspectos sobre a sua conservação genética. No trabalho experimental utilizaram-se dois tipos de marcadores moleculares: i) os marcadores bioquímicos que pretendem detectar polimorfismos a nível das isoenzimas e, ii) os marcadores de DNA (Ácido Desoxirribonucleico), baseados em técnicas de PCR (Reacção em Cadeia pela Polimerase), nomeadamente os RAPD (Polimorfismos de DNA Amplificados Aleatoriamente). Numa primeira fase descrita no capítulo 2 estudaram-se os seguintes marcadores moleculares isoenzimáticos: i) β-EST (β-esterase); ii) DIA (diaforase); iii) GOT (glutamato-oxalacetato-transaminase); iv) MDH (malato-desidrogenase); v) PGI (fosfoglucose-isomerase); vi) 6-PGD (6-fosfogluconato-desidrogenase) and, vii) PER (peroxidase). Estes permitiram, com êxito, a distinção genética das quatro populações escolhidas para este trabalho: de castanheiros resistentes; de castanheiros susceptíveis; de castanheiros híbridos e de cultivares portuguesas. Na quantificação da variabilidade genética, foram utilizados os seguintes parâmetros genéticos: índice de polimorfismo; número médio de alelos por locus; frequências alélicas; heterozigocidade; diversidade genética total, inter e intrapopulacional e o coeficiente de diferenciação genética. A metodologia utilizada na análise estatística das relações genéticas entre as populações compreendeu a ACP (Análise em Componentes Principais) e a análise de cluster. Concluiu-se que o sistema enzimático PGI permitiu uma boa distinção entre as populações contudo, os restantes sistemas enzimáticos também são marcadores aceitáveis na distinção de populações. As populações de híbridos e de cultivares portuguesas eram constituídas por variedades diferentes, contudo, as árvores pertencentes à mesma variedade apresentaram o mesmo genótipo indiciando a presença de clones idênticos. Apresenta-se no capítulo 3 a caracterização genética das mesmas populações através da técnica de RAPD. Os resultados foram concordantes com os obtidos na análise isoenzimática, confirmando o pressuposto da utilização destes marcadores na descrição da estrutura genética das populações. A metodologia empregue na análise estatística da variabilidade RAPD foi em todo idêntica à que foi utilizada na análise isoenzimática. As isoenzimas revelaram-se úteis na distinção interpopulacional, enquanto os RAPD poderão ser utilizados de uma forma eficaz na distinção intrapopulacional. O capítulo 4 inclui um estudo de caracterização dos compostos fenólicos em folhas de castanheiro, atendendo a que estes compostos possuem um papel importante na defesa das plantas contra os ataques de microorganismos e insectos. Além deste estudo, fez-se a avaliação, in vitro, do efeito dos compostos fenólicos no crescimento de Phytophthora cinnamomi Rands. A separação, identificação e quantificação dos compostos fenólicos foi realizada por HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência). A análise estatística dos resultados obtidos incidiu num modelo de análise de variância. No estudo estatístico das eventuais relações genéticas entre as árvores utilizou-se a ACP. Tanto o processo de extracção como o de quantificação de compostos fenólicos, por HPLC, revelaram-se métodos adequados para o material em estudo. Ao longo de toda a tese torna-se evidente a singularidade do clone COLUTAD, que é considerado um clone resistente à doença da tinta e que poderá, por isso, ser alvo de um estudo mais abrangente com vista ao melhoramento da espécie.

The European chestnut tree (Castanea sativa Mill) is an economical important specie and, because of that, its intensive cultivation has been inducing the loss of genetic variability which results in an increase of chestnut stands sensibility to fungi-like species that are responsible for several diseases, e.g. the ink disease. The present thesis aims to contribute and increase the knowledge about the genetic variability of chestnut tree (Castanea spp) populations. Chapter 1 describes the actual knowledge of the specie, which comprises the origin, botanical and ecological-cultural characteristics, pathology and some aspects concerning its genetic conservation. In the experimental work, two different types of molecular markers were used: i)biochemical markers that pretends to detect the polymorphism at the isoenzymes level and ii) DNA (Deoxiribonucleic Acid) markers, based on PCR (Polymerase Chain Reaction) techniques, namely the RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA). Chapter 2, describes the study of the following molecular isoenzymatic markers: i) β-EST (β-esterase); ii) DIA (diaphorase); iii) GOT (glutamate-oxalacetate-transaminase); iv) MDH (malate-desidrogenase); v) PGI (phosphoglucose-isomerase); vi) 6-PGD (6-phosphogluconate-desidrogenase) and, vii) PER (peroxidase). These markers permitted the genetic distinction of the four population that were chosen for this work: i) the resistant chestnut; ii) the susceptible chestnut; iii) the hybrid chestnut, and iv) the Portuguese cultivars chestnut. On the genetic variability quantification, the following genetic parameters were used: i) polymorphism index; ii) mean number of alleles per locus; iii) allelic frequency; iv) heterozygocity; v) total genetic diversity, inter- and intra-population; and vi) the coefficient of genetic differentiation. The method used to analyse the relationship among the studied populations comprised the PCA (Principal Component Analysis) and the cluster analysis. At this point, it is concluded that the enzyme PGI permitted a good distinction among populations while the remaining enzymes were also acceptable markers. The hybrid and the Portuguese cultivar populations were constituted by different varieties but, the trees of the same variety presented the same genotype, indicating the presence of identical clones. A genetic characterisation by means of the RAPD methodology was applied to the same populations (Chapter 3). The results obtained, using this method, came in agreement with the results obtained with the isoenzymatic analysis which confirmed the assumption of using these markers to describe the genetic structure of the populations. The method used for the statistical analysis of RAPD variability was identical to that used on isoenzymatic analysis. Isoenzymes revealed to be useful to discern among populations while RAPD, presenting a high potential on the Castanea sativa analysis, can be used in an efficient way to discern individuals inside the populations. Chapter 4 includes a study of phenolic compounds characterisation on chestnut leaves, as phenolic compounds were considered to have an important role on plant defence against microorganisms and insect attackes. Besides this study, the effect of phenolic compounds on the growing of Phytophthora cinnamomi Rands was evaluated in vitro. The separation, identification and quantification of phenolic compounds was performed using the HPLC (High Performance Liquid Chromatography) methodology. The statistical analysis of the results was based on the variance analysis model. The PCA analysis was used to study the eventual relationship between different trees. The processes of extraction and quantification of phenolic compounds, by HPLC, revealed to be adequate methods for the material in study. The singularity of the COLUTAD clone became evident along the thesis. This clone, considered to be resistant to the ink-disease, could be the subject of a broader study in order to improve it.