In vivo assessment of the host reactions to natural origin biomaterials aimed to be used as wound dressers and as bone tissue engineering scaffolds

• Author(s): Santos, T. C.
• Date: 2010
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/1822/10474
• Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
• Subject(s): 611-018; 620.1:61; 61:620.1
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Reis, R. L.; Castro, António G.
• Contributor(s): Universidade do Minho

Description

Tese de doutoramento em Ciência e Tecnologia de Materiais (ramo de conhecimento em Engenharia de Tecidos - Materiais Híbridos)

The development, in recent years, of novel biomaterials for tissue engineering (TE) and regenerative medicine, is an attempt to give an answer to the rising needs of the new tissue replacement/regeneration strategies. However, the increasing complexity of TE devices, comprising cells and/or bioactive agents within 3D scaffolding structures, implies additional concerns regarding adverse host reactions to the implantable constructs. Despite all the investment in the research on stem cells technology, as well as in the identification of key mediators in inflammation/immune reaction and differentiation pathways, the role of support biomaterials in the host reaction has been somewhat neglected. Natural-origin biomaterials have been considered for many years as a way to improve, in comparison to synthetic polymers, in vivo biofunctionality and to modulate/avoid a harmful host response due to its similarities with biological molecules. This PhD work attempted to gather deeper knowledge on the host reactions elicited by natural-origin biomaterials processed under different conditions and aimed at skin wound dressing and bone TE applications. In a first approach, chitosan/soy membranes were tested for their in vitro ability to activate human polymorphonuclear neutrophils (PMNs), assessed by the quantification of lysozyme activity and reactive oxygen species (ROS) production. Chitosan/soy membranes were not able to activate PMNs in vitro thus the analysis of the in vivo performance of those materials was pursued. The influence of chitosan and soy on the elicited inflammation was quantified after intraperitoneal implantation in rats. Soy isolate protein induced the recruitment of higher numbers of leukocytes and elicited a considerable reaction from the host in comparison to chitosan. Additionally, the chitosan/soy-membranes induced of a normal host response after subcutaneous implantation in rats while soybean membranes elicited a severe tissue reaction. In conclusion, an improved host response, considering inflammatory cells’ recruitment and overall inflammatory reaction, was observed when chitosan was combined with soybean. Considering a potential application of these chitosan/soy membranes as wound dressers, a rat partial-thickness skin wound model was used to assess the suitability of the membranes in promoting wound healing. A rapid but, most importantly, functional regeneration was achieved in the chitosan/soy membranes dressed wounds. The re-epithelisation, observed only one week after wounding, was followed by the cornification of the outermost epidermal layer indicating a functional recovery of the excised tissue. These new chitosan/soy membranes showed to possess the desired features in terms of healing stimulation, ease of handling and final aesthetic appearance to be considered useful as wound dressers. Starch-based biomaterials have been extensively studied in vitro aiming at different TE applications. Previous in vitro studies with starch and polycaprolacatone (SPCL) scaffolds have proved the great potential of these structures. Thus, an in vivo systematic study was carried out using two different rat implantation models, subcutaneous (SC) and intramuscular (IM), and aiming at primarily understand the tissue reaction to two SPCL-based scaffolds produced by different methodologies, wet spinning (SPCL-WS) and fibre-bonding (SPCL-FB), both at short and long term implantation periods. SPCL-WS scaffolds seemed to induce a lower inflammatory/immune reaction in both types of implantation models even if when comparing the two models, the IM implantation resulted in a higher inflammatory response than the SC implantation, with early activation of the lymph nodes for both scaffolds. The overall data suggested a good integration of the polymeric structures in the host, independently of the implantation site, with a normal progression of the inflammatory reaction for all the conditions. Different biomaterials, cells, growth factors and stimulation conditions, as well as numerous combinations among them, have been widely proposed as potential routes to achieve the perfect bone TE construct. Despite this, in bone TE, vascularisation remains a rather big concern, not yet perfectly addressed. A valuable alternative to tackle the vascularisation of bone TE constructs relies on the incorporation in the construct of important mediators, such as vascular endothelial growth factor (VEGF) and fibroblast growth factor (FGF), which can be released in a controlled manner from the scaffolding material. To pursue this, SPCL-WS and SPCL-FB scaffolds were seeded with transfected human Adipose-derived Stem Cells (hASCs) and their movement was followed after implantation of the constructs into nude mice. Additionally, bone TE constructs were assembled using the SPCL scaffolds, fibrin sealant (Baxter®), hASCs, and growth factors (VEGF or FGF-2), and implanted in vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2)-luc transgenic mice. The behaviour of transfected hASCs after transplantation was similar for both the SPCL-WS and the SPCL-FB scaffolds. Furthermore a mild inflammatory reaction was observed after transplantation of the assembled constructs and, as expected, the release of VEGF and FGF-2 from the constructs enhanced the expression of VEGFR-2 as well as specific molecular markers of neovascularisation. The overall data confirmed that the developed chitosan/soy membranes represent a valuable alternative for wound dressing applications and that starch-based constructs are promising approaches for bone TE applications.

O desenvolvimento de novos biomateriais para Engenharia de Tecidos (ET) e medicina regenerativa representa uma tentativa de responder à necessidade de novas estratégias para a regeneração e substituição de tecidos. No entanto, a crescente complexidade dos dispositivos de ET, que compreendem células e/ou agentes bioactivos no interior de estruturas de suporte tridimensionais, implica novas preocupações relativamente a reacções adversas desencadeadas pelo hopedeiro a esses mesmos dispositivos. Apesar de todo o investimento na investigação relacionada quer com as células estaminais, quer com a identificação de mediadores chave na reacção inflamatória e vias de diferenciação, o papel dos materiais de suporte na reacção imune do hospedeiro tem sido algo negligenciada. Os biomateriais de origem natural têm sido considerados, desde há alguns anos, como uma forma de melhorar, comparativamente aos polímeros sintéticos, aspectos da biofuncionalidade in vivo e de modular/evitar uma recção adversa do hospedeiro, devido às suas semelhanças com moléculas biológicas. Este trabalho de doutoramento foi desenvolvido de forma a adquirir um conhecimento mais profundo das reacções do hospedeiro, desencadeadas por biomateriais de origem natural, processados em diferentes condições, e produzidos para utilização em revestimento/protecção de lesões de pele, bem como em aplicações de ET ósseos. Numa primeira fase, foi testada a capacidade de membranas de quitosano/soja activarem neutrófilos (PMNs) humanos em cultura, através da quantificação da actividade da lisozima e da produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS). As referidas membranas não foram capazes de activar os PMNs em cultura, procedendo-se, de seguida, à análise da performance daqueles materiais após implantação. A influência do quitosano e da soja na inflamação provocada foi quantificada após implantação intraperitoneal em ratos. O isolado de proteína de soja induziu o recrutamento de um número mais alto de leucócitos e provocou uma reacção considerável do hospedeiro, em comparação com o quiotosano. Adicionalmente, as membranas de quitosano/soja induziram uma resposta normal do hospedeiro após implantação subcutânea em ratos, enquanto que as membranas de soja provocaram uma reacção tecidular severa. Em conclusão, foi observada uma melhoria na reacção do hospedeiro, do ponto de vista do recrutamento de células inflamatórias e reacção inflamatória geral, quando o quitosano foi combinado com a soja. Considerando uma potencial aplicação destas membranas de quitosano/soja como revestimento e protecção de lesões, foi utilizado um modelo de lesão de espessura parcial de pele em rato, para determinar a capacidade das membranas de auxiliarem a regeneração das lesões. Uma regeneração mais rápida e, ainda mais relevante, funcional foi conseguida nas lesões revestidas com as membranas de quitosano/soja. A re-epitelização, observada apenas uma semana após a lesão, foi seguida pela cornificação da camada exterior da epiderme, indicando uma recuperação funcional do tecido excisado. Estas novas membranas de quitosano/soja mostraram possuir características adequadas em termos de estimulação da regeneração, facilidade de manipulação e aparência estética final, de forma a serem consideradas como boas opções para o revestimente e protecção de lesões cutâneas. Os biomateriais à base de amido têm sido extensivamente estudados in vitro tendo em vista diferentes aplicações de ET. Estudos in vitro anteriores utilizando suportes de amido e policaprolactona (SPCL) provaram já o grande potencial destas estruturas. Assim, foi elaborado um estudo in vivo sistemático, utilizando dois modelos de implantação em ratos, subcutâneo (SC) e intramuscular (IM), com o objectivo de compreender a reacção tecidular a dois suportes tridimensionais de SPCL, produzidos de duas formas distintas, wet spinning (SPCL-WS) e fibre bonding (SPCL-FB) em ambos períodos de implantação, curto e longo. Os suportes de SPCLWS induziram uma reacção inflamatória/imune menor nos dois tipos de modelo de implantação, mesmo tendo em conta que, comparando os dois modelos, o modelo IM revelou uma resposta inflamatória mais intensa do que o modelo SC, com uma activação inicial dos nódulos linfáticos para ambos os suportes. A totalidade dos dados sugeriu uma boa integração das estruturas poliméricas nos tecidos do hospedeiro, independentemente do local de implantação, com uma progressão normal da reacção inflamatória para todas as condições. Diferentes biomateriais, células, factores de crescimento e condições de estimulação, bem como várias combinações entre estes factores, têm sido largamente propostos como potenciais formas de atingir o dispositivo de ET ósseos perfeito. No entanto, a vascularização permanece como uma grande preocupação na ET de osso e ainda não correctamente estudada. Uma possível alternativa para ultrapassar o problema da vascularização de dispositivos para ET ósseos consiste na incorporação no próprio dispositivo, de importantes mediadores, como o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o factor de cresciemento fibroblástico (FGF). Estes factores podem ser libertados de uma forma controlada do material que compõe os dispositivos. Para avaliar, na prática, esta tecnologia, suportes de SPCL-WS e SPCL-FB foram semeados com células estaminais humanas do tecido adiposo (hASCs) transfectadas e o seu movimento foi seguido após implantação em ratinhos immunossuprimidos (nude). Além disso, os dispositivos para ET de osso foram produzidos utilizando suportes de SPCL, selante de fibrina (Baxter®), hASCs e factores de crescimento (VEGF ou FGF-2) e implantados em ratinhos transgénicos VEGFR2-luc. O comportamento das hASCs transfectadas foi similar para ambos os tipos de suportes, SPCL-WS e SPCL-FB. Mais ainda, foi observada uma ligeira reacção inflamatória após a transplantação dos suportes e, tal como o esperado, a libertação de VEGF e FGF-2 dos suportes induziu o aumento da expressão de VEGFR-2, bem como de marcadores moleculares específicos de neo-vascularização. No seu conjunto, estes resultados confirmaram que as membranas de quitosano/soja desenvolvidas representam uma valiosa alternativa para aplicação em revestimento e protecção de lesões cutâneas, e que a utilização de suportes baseados em amido é uma estratégia promissora para aplicações em ET ósseos.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - PhD grant SFRH/ BD/ 40861/ 2007

European Network of Excellence EXPERTISSUES (NMP3-CT-2004-5000283)

Marie Curie European program (MEST-CT-2004-008104)