Insights into the ecology of polymicrobial biofilms involved in cystic fibrosis

• Author(s): Lopes, Susana Patrícia
• Date: 2013
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/1822/28811
• Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
• Subject(s): 616-056.7
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Pereira, Maria Olívia; Azevedo, N. F.
• Contributor(s): Universidade do Minho

Description

Tese de doutoramento em Chemical and Biological Engineering

Cystic Fibrosis (CF), a lethal hereditary disorder, is characterized by high rates of morbidity and mortality caused by pulmonary microbial infections. Pseudomonas aeruginosa is typically the prevailing pathogen in the airways of CF patients, but advances in molecular technologies have disclosed an emergent and diverse microbial community inhabiting CF lungs. For most of these microbes, the pathogenesis, clinical relevance, adaptation to CF airways niche, antimicrobial susceptibilities and even interactions with other CF-associated pathogens remains poorly understood. As such, this work aimed at giving insights into the physiology, phenotype and ecology of polymicrobial communities involving traditional and emergent bacteria associated to CF. Therefore, Inquilinus limosus and Dolosigranulum pigrum, two emergent bacteria that have been frequently recovered from CF airways, as well as the CF-classical pathogen P. aeruginosa, were used throughout this work. At a first stage of this work, the ability of I. limosus and D. pigrum to develop single- and dual-species biofilms together with P. aeruginosa under standard aerobic conditions and to resist towards a range of antibiotics from varied classes was examined. Results showed that both emergent bacteria produced significantly less biomass than P. aeruginosa and displayed greater sensitivity to antibiotics when singlespecies biofilms were formed. However, when grown in dual-species consortia with P. aeruginosa, the presence of I. limosus and D. pigrum was crucial in increasing the antibiotic-resistance of the overall consortia, independently of the reduced biofilm biomass formed and a decrease in biofilm matrix content. Based on these initial findings that revealed microbial interactions between the CF-emergent species with a CF-major pathogen and knowing that zones with steep oxygen gradients occur within the CF airways, it was considered pivotal to investigate the biofilm-forming ability of such individual species and their antibiotic susceptibilities under oxygen-variable atmospheres (aerobic, microaerophilic and anaerobic). Results demonstrated that all bacteria were able to develop monospecies biofilms under different atmospheres. Unlike earlier results, the emergent biofilms displayed multi-drug resistance under aerobic conditions, which was higher than for P. aeruginosa, and endured even for low-oxygen environments. Such findings reveal that I. limosus, D. pigrum and P. aeruginosa seem to easily adapt to the CF airways environments. Fluorescence in situ hybridization using peptide nucleic acid probes (PNA FISH) has been pinpointed as a valuable molecular tool for microbial identification and discrimination within polymicrobial communities. As such, two PNA probes were designed and developed to accurately distinguish and localize P. aeruginosa and I. limosus within the polymicrobial consortia. These PNA probes - Paer565 and Ilim569 - yielded high theoretical specificities (~100% for both) and sensitivities (90.3 and 87.5%, respectively for Paer565 and Ilim569) in identifying the corresponding target microorganisms (P. aeruginosa and I. limosus). Posteriorly, a multiplex PNA FISH assay combined with 4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI, (to identify D. pigrum) was validated for the precise discrimination of the three populations within mixed-species biofilms. Previous findings have shown that I. limosus and D. pigrum could easily adapt to the CF airways environments, but how they interacted and contributed to the polymicrobial consortia with CF-common pathogens, under such conditions, was still to be disclosed. As such, I. limosus and D. pigrum were grown in dual- and three-species populations with P. aeruginosa under variable oxygen atmospheres and the biofilms were thoroughly characterized for biomass, respiratory activity, colony-forming units (CFU) number, antibiotic resistance profiles, and relative distributions of bacterial populations. The PNA FISH method developed before was employed to directly localize and discriminate the bacterial populations within the consortia. Results showed that multi-species biofilms displayed enhanced antibiotic-resistance compared with single-species biofilms. Dual-species biofilms displayed the lowest CFU reductions after antibiotic treatment and even less under low-oxygen atmospheres. Regarding microbial composition, dual-species biofilms presented similar bacterial proportions, whereas P. aeruginosa and D. pigrum dominated the threespecies consortia, with I. limosus as the smallest representative population. In general, biofilm compositions changed in result of antibiotic treatment, with alterations being dependent on the antibiotic, concentration and oxygen conditions used. The consortia encompassing I. limosus and P. aeruginosa were dominated by the latter species in aerobiosis. However, the survival of I. limosus towards antibiotics under anaerobic conditions led this species to occupy a significant portion together with P. aeruginosa in the overall biofilm, which indicates that I. limosus had a preponderant role in increasing the whole resistance of biofilms, particularly under anaerobiosis. The three-species biofilms displayed the highest sensitivity (the eradication was achieved for levofloxacin and ciprofloxacin), with D. pigrum and/or P. aeruginosa dominating and I. limosus declining for most cases. It is concluded, therefore, that the preponderance of D. pigrum in the biofilm was decisive to decrease I. limosus and lead to an increase in overall sensitivity of the biofilm to a large number of antibiotics. PNA FISH allowed the direct observation of the location and distribution of the three-species species within the biofilms, corroborating the dominance of D. pigrum and P. aeruginosa within the mixed-species consortia (determined by CFU counting) and facilitating the understanding of the real complex interactions among the bacterial species. In summary, I. limosus and D. pigrum could easily adapt and survive as biofilms, a common trait associated to virulence, under oxygen conditions resembling the airways of CF patients. Both species were also able to grow associated with the common pathogen P. aeruginosa, leading to polymicrobial consortia with antibiotic resilience and shaping social interactions in the consortia. Interestingly, this work offers a new approach in antibiotherapy targeting biofilm-related infections based on disturbing one member of the community to facilitate the subsequent treatment of the biofilm by antibiotics. Hence, these studies should be extended to other emergent microbes and encourage rethinking the in-use CF antibiotic treatment and eventually the search for new safe and efficient antimicrobial strategies targeting biofilms that may cause severe infection, thus ensuring quality of care and minimizing the risk of mortality in CF patients.

A Fibrose Cística (FC) é uma doença crónica hereditária que se caracteriza por altas taxas de morbilidade e mortalidade decorrentes de infeções pulmonares. Pseudomonas aeruginosa é a espécie bacteriana mais predominante nas vias respiratórias dos pacientes com FC. No entanto, a evolução das tecnologias moleculares tem revelado a existência de uma comunidade microbiana diversificada. Para a maioria destes microrganismos emergentes, o potencial patogénico, a relevância clínica, a adaptação às condições das vias respiratórias, a suscetibilidade a agentes antimicrobianos e as interações entre espécies ainda são pouco compreendidos e explorados. Neste cenário, este trabalho teve como objetivo contribuir para o conhecimento da fisiologia, fenótipo e ecologia de comunidades polimicrobianas de bactérias tradicionais e emergentes associadas à FC. Assim, este trabalho incluiu, para além da bactéria clássica P. aeruginosa, duas bactérias emergentes que têm sido frequentemente recuperadas de pacientes com CF, Inquilinus limosus e Dolosigranulum pigrum. Na primeira etapa do trabalho foi investigada a capacidade de I. limosus e D. pigrum de desenvolver biofilmes simples e duplos com P. aeruginosa em condições aeróbias, bem como conhecer os perfis de suscetibilidade a antibióticos de diferentes classes. Os resultados mostraram que os biofilmes formados pelas bactérias emergentes apresentaram significativamente menos biomassa e exibiram uma maior sensibilidade aos antibióticos, quando comparados com P. aeruginosa. Contudo, quando cresceram em biofilmes duplos com P. aeruginosa, a presença de I. limosus e D. pigrum aumentou a resistência do consórcio aos antibióticos, independentemente dos biofilmes duplos terem menor massa e menor conteúdo de matriz. Estes resultados preliminares indiciaram que se estabelecem interações entre as bactérias emergentes e P. aeruginosa que se repercutem na resposta da comunidade microbiana total. Consequentemente, sabendo que as vias respiratórias da FC compreendem zonas com gradientes de oxigénio, considerou-se crucial investigar a capacidade de formação de biofilme em ambientes com concentração de oxigénio variável (aeróbio, microaerofílico e anaeróbio), bem como conhecer a respetiva suscetibilidade a antibióticos. Os resultados demonstraram que todas as bactérias foram capazes de desenvolver biofilme nos diferentes ambientes. No entanto, contrariamente aos resultados precedentes, os biofilmes simples formados pelas espécies emergentes em condições aeróbias exibiram resistência a múltiplos antibióticos superior à revelada por P. aeruginosa, resistência que se manteve até em ambientes com deficiência de oxigénio. Estes resultados mostraram que I. limosus, D. pigrum e P. aeruginosa parecem adaptar-se facilmente a ambientes similares aos das vias respiratórias de pacientes com FC. A hibridação fluorescente in situ combinada com moléculas de ácido péptido-nucléico (PNA FISH) tem sido reconhecida como uma ferramenta valiosa para a identificação e discriminação de microrganismos em comunidades polimicrobianas. Assim, no âmbito deste trabalho procedeu-se à conceção e desenvolvimento de duas sondas PNA para distinguir e localizar com precisão P. aeruginosa e I. limosus nos consórcios polimicrobianos. Estas sondas - Paer565 e Ilim569 - apresentaram elevada especificidade (~100%) e sensibilidade teóricas (90,3 e 87,5%, respetivamente para Paer565 e Ilim569) na identificação dos respetivos microrganismos-alvo (P. aeruginosa e I. limosus). Posteriormente, através de uma abordagem “multiplex” (utilização das duas sondas em simultâneo), o método PNA FISH foi combinado com 4',6- diamidino-2-phenylindole, DAPI, (para identificar D. pigrum) tendo sido testado e validado na deteção das três populações em biofilmes multi-espécie. Como demonstrado, I. limosus, D. pigrum e P. aeruginosa parecem adaptar-se facilmente a ambientes com diferentes gradientes de oxigénio. No entanto, ainda não há muita informação acerca de como estas bactérias interagem entre si, nas várias condições de oxigénio existentes nas vias respiratórias da FC, e de como contribuem para a resposta global dos consórcios polimicrobianos. Sendo assim, desenvolveram-se biofilmes duplos e triplos envolvendo D. pigrum e I. limosus com P. aeruginosa em concentrações de oxigénio variáveis, tendo estes sido, posteriormente, caracterizados relativamente à quantidade de biomassa, atividade respiratória, células cultiváveis, perfis de resistência a antibióticos e distribuição relativa de populações bacterianas. O método PNA FISH foi utilizado para localizar e distinguir as populações de bactérias nos consórcios polimicrobianos. Os resultados mostraram que, para os três ambientes de oxigénio simulados, os biofilmes multi-espécie exibiram resistência a vários antibióticos superior à revelada pelos biofilmes simples. Refira-se, no entanto, que foram os biofilmes duplos os que sofreram menor redução do número de células viáveis em consequência da ação dos antibióticos, redução essa ainda menos significativa nos ambientes de baixa oxigenação. Em termos de composição microbiológica, os biofilmes duplos apresentaram proporções similares das espécies bacterianas. Nos biofilmes triplos, P. aeruginosa e D. pigrum preponderaram apresentando proporções similares, sendo I. limosus a espécie bacteriana com menor representatividade no biofilme total. De uma forma geral, após tratamento com antibióticos, a composição dos biofilmes alterou-se, sendo esta alteração dependente do antibiótico, da concentração e das condições de oxigénio implementadas. No caso dos biofilmes duplos de I. limosus e P. aeruginosa, esta última dominou o consórcio nas condições aeróbias, mas I. limosus foi capaz de resistir à ação dos antibióticos em condições anaeróbias, ocupando uma fração significativa do biofilme juntamente com P. aeruginosa. Estes dados parecem indicar que a presença de I. limosus na comunidade tem um papel preponderante no aumento da resistência do biofilme polimicrobiano, sobretudo quando o biofilme se desenvolve em anaerobiose. Relativamente aos biofilmes triplos, estes mostraram ser os mais sensíveis a antibióticos (a erradicação foi conseguida para levofloxacina e ciprofloxacina), com o D. pigrum e/ou P. aeruginosa a predominarem no consórcio, e com I. limosus a ser diminuído na maior parte dos casos. Conclui-se, assim, que a preponderância de D. pigrum no biofilme foi decisiva para perturbar I. limosus e levar a um aumento da sensibilidade do biofilme total para um grande número de antibióticos. O método PNA FISH permitiu localizar as populações nos biofilmes, corroborando a dominância de D. pigrum e P. aeruginosa dentro do biofilme triplo, e facilitou a compreensão das interações complexas existentes entre as espécies bacterianas