Author(s):
Alves, Catarina Vieira Moniz 
Date: 2008
Persistent ID: http://hdl.handle.net/1822/7679
Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
Document details
The role of protein interactions with novel starch based polymeric implant mate...
Description
The importance of cell-protein-surface interactions is commonly accepted as a key step for the successful application of any biomaterial. Immediately upon contact with physiological fluids many proteins adsorb to the implant surface, subsequently promoting nearby cells to indirectly interact with the material. Either in in vivo or in vitro conditions, cells are known not to interact with biospecies-free surfaces. Along with a number of other interfacial processes, the amount, type and conformation of adsorbed proteins regulate the bio-integration of an implant, thus defining its final outcome: integration or rejection. The paradigm of cell material interactions, which considers that protein adsorption as the first event following contact and determines the later interactions of the cell, could be central to the design of new strategies for biocompatibility and tissue engineering. Many authors consider protein adsorption as a material/surface dependent phenomenon and many attempts have been made in order to achieve perfect compromise between materials and biocompatibility by means of manipulating protein behaviour at interfaces. From a functional point of view, it is accepted that qualitative and quantitative assessment of the affinity of proteins to surfaces is essential to evaluate cell mechanisms upon attachment to the surfaces and thus develop improvements in the properties of implanted materials. The materials investigated in this research have already been utilised for a range of applications in the biomedical field. Blends of corn starch with cellulose acetate (SCA), ethylene vinyl alcohol (SEVA-C) and polycaprolactone (SPCL); hydroxyapatite reinforced SCA (SCA+10%HA); and poly[D,L-lactic acid] (PDLLA) were studied. Starch based biomaterials (SBB) and PDLLA have shown to exhibit an in vitro and in vivo biocompatible behaviour. Although several cell studies were previously conducted, the adsorption behaviour of biomolecules relevant for the cell-biomaterial interactions had yet to be understood. For that, the PhD work plan that culminated in this thesis was conducted to determine different aspects, directly related with surface-protein and surface-protein-cell issues: (i) to investigate protein distribution onto the surface of starch based polymers; (ii) to analyse the effect of surface chemistry in the adsorption of proteins; (iii) to assess the kinetics and adsorption isotherms of clinically relevant proteins; (iv) to explore protein competition, exchange and desorption from the surfaces; (v) to evaluate the influence of proteinssurface systems in cell adhesion, proliferation and morphology; and finally, (vi) to investigate protein behaviour onto the surface of implanted materials. In the initial evaluation of protein adsorption onto SBB surfaces, single, binary and complex protein solutions were used. The distribution of the molecules was found to depend on the surface studied regardless of the protein specie. In single protein systems a preference for fibronectin and vitronectin adsorption in comparison to albumin was demonstrated, the laters adsorption potential was further decreased in competitive conditions. SPCL presented the highest protein adsorption levels. For the studied serum concentrations all the surfaces generally indicated good vitronectin adsorption. In the second part of this study, the effect of proteins on modulating leukocyte adhesion showed short and long-term effects in cell adhesion developed by vitronectin and albumin, respectively. The effect of oxygen-based plasma treatment on the different surfaces and the influence of proteins adsorption on modulating bone-cells behaviour were studied. Both SBB and PDLLA surface properties were affected by the selected surface modification technique, which increased albumin and fibronectin adsorption onto treated PDLLA. The crucial role of adsorbed proteins in mediating the response of osteogenic cells to the treated PDLLA surface was demonstrated. Regarding SBB surfaces, the absence of pre-incubated proteins showed to improve osteoblast-like cells proliferation onto plasma treated SPCL. Moreover, the pre-adsorbed proteins primarily defined MG63 cells morphology on SEVA-C surfaces, while on SPCL it was mainly affected by the plasma treatment. The correlation between the surface characteristics and protein adsorption isotherms from unitary and complex protein systems was investigated onto starch based materials. Albumin adsorption on SBB was affected by the material composition as well as by the concentration of the protein solution, preferentially adsorbing onto SCA and SPCL. Fibronectin adsorption reached higher values on SEVA-C and SPCL. There was no effect on the adsorption of albumin and fibronectin onto SPCL in competitive conditions. In the presence of albumin, fibronectin adsorption was reduced on SCA, while the opposite situation was observed for SEVA-C. Fibronectin demonstrated a different adsorption activity for the different materials as assessed by single and competitive adsorption with albumin. The adsorption/desorption study of plasma proteins on SBB surfaces was performed by multiloop Dynamic Contact Angle (DCA). In this study, the analysis of the hysteresis, advancing and receding wetting tensions indicated that adsorbed proteins could desorb more readily on SCA and SPCL than on SEVA-C. In the later case, stronger interactions such as hydrophobic forces were established, which could indicate the rearrangement of protein conformation. The physicochemical relationship between different biological molecules and SEVA-C was investigated in vivo. Results indicated that albumin and vitronectin were absent from the immediate tissue-implant interface and diffused into the bulk of the material. In contrast, fibronectin adsorption presented multilayer patterns that displaced fibrinogen from SEVA-C surfaces. In general, the adsorptive potential of albumin, fibronectin and vitronectin was characterized and SPCL surfaces showed increased adsorption levels for both unitary and complex protein systems. Protein distribution and desorption profiles were obtained and SEVA-C showed the lowest desorption ability. In vitro cell studies showed that PDLLA and SPCL were highly sensitive to the surface modification, and that cell response to SEVA-C was highly modulated by pre-adsorbed molecules. Finally, in vivo studies provided further insights into the dynamics established between different proteins and SEVA-C material. A importância atribuída à interacção entre células, proteínas e superfícies é geralmente considerada como um passo fundamental para a aplicação bem sucedida de qualquer biomaterial. Após o contacto com fluidos fisiológicos, muitas proteínas adsorvem às superfícies implantadas, induzindo a interacção indirecta das células com o material. Nas condições in vivo e in vitro é sabido que as células, geralmente, não interagem com as superfícies implantadas na ausência de biomoléculas. À semelhança de outros processos de interface, a quantidade, tipo e conformação das proteínas adsorvidas regulam a biointegração de um implante, definindo, assim, o seu resultado final: integração ou rejeição. O paradigma das interacções entre células e superfícies, que considera a adsorção de proteínas o primeiro acontecimento depois da existência de contacto e que determina os processos celulares consequentes, pode ser fulcral para o desenvolvimento de novas estratégias de biocompatibilidade e engenharia de tecidos. A adsorção de proteínas é considerada por muitos autores como um fenómeno dependente do material/superfície. Diversos estudos foram desenvolvidos com o intuito de atingir um compromisso perfeito entre material e biocompatibilidade através da manipulação do comportamento das proteínas nas superfícies. Do ponto de vista funcional, o estudo qualitativo e quantitativo da afinidade de proteínas a superfícies é essencial na avaliação dos mecanismos posteriores às interacções célula-superfície permitindo, deste modo, melhorar as propriedades de biomateriais implantados. Os materiais utilizados neste trabalho foram estudados para diversas aplicações na área da biomedicina, designadamente, misturas de amido de milho com acetato de celulose (SCA) etileno álcool-vinílico (SEVA-C) e policaprolactona (SPCL); SCA com hidroxiapatite (SCA+10%HA); e poli-D,L-ácido láctico (PDLLA). Os materiais à base de amido de milho e o PDLLA demonstraram, tanto in vivo com in vitro, um comportamento biocompatível. Embora vários estudos de biologia celular tenham sido efectuados, o efeito da adsorção de biomoléculas com relevância clínica nas interacções entre células e superfícies ainda não é totalmente conhecido. Neste contexto, foi delineado um plano de trabalhos, que deu origem a esta tese, com o objectivo de avaliar diferentes aspectos da interacção entre proteínas, células e superfícies dos materiais, nomeadamente: (i) a distribuição de proteínas nas superfícies em estudo, (ii) o efeito da química de superfícies na adsorção proteíca, (iii) a cinética de adsorção de proteínas, (iv) aspectos de competição, troca e desadsorção de biomoléculas, (v) a influência das proteínas na adesão, proliferação e morfologia celulares, e finalmente, (vi) o comportamento de moléculas na interface implante-tecido. Numa fase inicial da avaliação da adsorção de proteínas foram utilizadas soluções proteicas simples, binárias e complexas. Concluiu-se que a distribuição das moléculas depende da superfície em estudo, e não do tipo de proteínas utilizadas. Em sistemas proteicos simples verificou-se a preferência pela adsorção da fibronectina e vitronectina em comparação com a albumina, cujo potencial de adsorção diminui em condições competitivas. Os níveis mais altos de adsorção de proteínas foram obtidos pelo SPCL. Todas as superfícies demonstraram, em termos gerais, uma boa adsorção de vitronectina nas concentrações de soro estudadas. Numa segunda fase deste estudo, a influência das proteínas na adesão de leucócitos apresentou efeitos a curto e a longo prazo na adesão celular desenvolvidas, respectivamente, pela vitronectina e albumina. Foi ainda estudado o efeito do tratamento por plasma de oxigénio nas diferentes superfícies e a influência da adsorção de proteínas no comportamento das células do osso. As propriedades do PDLLA e dos materiais à base de amido de milho foram modificadas pela técnica seleccionada, resultando no aumento de adsorção de albumina e de fibronectina nas superfícies de PDLLA. Demonstrou-se também a função essencial das proteínas adsorvidas na resposta celular ao PDLLA modificado por plasma. Relativamente aos materiais à base de amido de milho, a ausência de proteínas pré-adsorvidas melhorou a proliferação de osteoblastos nas superfícies de SPCL modificadas. Além disso, as proteínas pré-adsorvidas influenciaram a morfologia das células MG63 nas superfícies de SEVA-C, enquanto que no SPCL as maiores alterações resultaram do tratamento por plasma. A relação entre as características das superfícies dos materiais à base de amido de milho e a adsorção de proteína foi estudada usando soluções proteícas simples e complexas. A adsorção de albumina foi influenciada pela composição dos materiais e pela concentração da solução proteíca, adsorvendo preferencialmente às superfícies de SCA e de SPCL. Por outro lado, a adsorção de fibronectina atingiu valores mais elevados na superfície de SEVA-C e de SPCL. Em condições competitivas nenhum efeito foi observado na adsorção da albumina e fibronectina ao SPCL. Na presença da albumina, a afinidade da fibronectina ao SCA diminuiu, enquanto que o contrário foi observado para o SEVA-C. Verificou-se que o comportamento da fibronectina na presença de albumina em condições competitivas difere do demonstrado em sistemas unitários. A adsorção/desadsorção de proteínas do plasma sanguíneo aos materiais à base de amido de milho foi estudada utilizando a técnica de Ângulo de Contacto Dinâmico. Neste estudo, a análise da histerese e das tensões de molhabilidade indicou que a desadsorção das proteínas é mais rápida nas superfícies de SCA e de SPCL do que nas de SEVA-C. Neste último material, estabeleceram-se interacções mais fortes (ligações hidrofóbicas), o que pode indicar o rearranjo da conformação proteíca. A relação físico-química entre as diferentes biomoléculas e as misturas poliméricas de SEVA-C foi estudada in vivo. Os resultados obtidos demonstraram a ausência de albumina e vitronectina na interface tecido-implante e a sua difusão no interior do material. Por outro lado, a fibronectina adsorveu em padrões de multicamadas, deslocando o fibrinogénio da superfície dos materiais implantados. Em termos gerais, o potencial de adsorção da albumina, fibronectina e vitronectina foi caracterizado. Nas superfícies de SPCL observaram-se os níveis mais elevados de adsorção utilizando sistemas proteicos unitários ou complexos. A distribuição das proteínas e os perfis de adsorção foram estudados e verificou-se que a mistura de SEVA-C apresenta menor capacidade de desadsorção. No que respeita aos estudos celulares, concluiu-se que o PDLLA e o SPCL foram os materiais mais afectados pelo tratamento por plasma e que o SEVA-C foi o material mais influenciado pela pré-adsorção de proteínas. Por último, os estudos in vivo permitiram aprofundar os conhecimentos sobre a dinâmica estabelecida entre diferentes proteínas e o SEVA-C. Tese de Doutoramento em Engenharia Biomédica
The importance of cell-protein-surface interactions is commonly accepted as a key step for the successful application of any biomaterial. Immediately upon contact with physiological fluids many proteins adsorb to the implant surface, subsequently promoting nearby cells to indirectly interact with the material. Either in in vivo or in vitro conditions, cells are known not to interact with biospecies-free surfaces. Along with a number of other interfacial processes, the amount, type and conformation of adsorbed proteins regulate the bio-integration of an implant, thus defining its final outcome: integration or rejection. The paradigm of cell material interactions, which considers that protein adsorption as the first event following contact and determines the later interactions of the cell, could be central to the design of new strategies for biocompatibility and tissue engineering. Many authors consider protein adsorption as a material/surface dependent phenomenon and many attempts have been made in order to achieve perfect compromise between materials and biocompatibility by means of manipulating protein behaviour at interfaces. From a functional point of view, it is accepted that qualitative and quantitative assessment of the affinity of proteins to surfaces is essential to evaluate cell mechanisms upon attachment to the surfaces and thus develop improvements in the properties of implanted materials. The materials investigated in this research have already been utilised for a range of applications in the biomedical field. Blends of corn starch with cellulose acetate (SCA), ethylene vinyl alcohol (SEVA-C) and polycaprolactone (SPCL); hydroxyapatite reinforced SCA (SCA+10%HA); and poly[D,L-lactic acid] (PDLLA) were studied. Starch based biomaterials (SBB) and PDLLA have shown to exhibit an in vitro and in vivo biocompatible behaviour. Although several cell studies were previously conducted, the adsorption behaviour of biomolecules relevant for the cell-biomaterial interactions had yet to be understood. For that, the PhD work plan that culminated in this thesis was conducted to determine different aspects, directly related with surface-protein and surface-protein-cell issues: (i) to investigate protein distribution onto the surface of starch based polymers; (ii) to analyse the effect of surface chemistry in the adsorption of proteins; (iii) to assess the kinetics and adsorption isotherms of clinically relevant proteins; (iv) to explore protein competition, exchange and desorption from the surfaces; (v) to evaluate the influence of proteinssurface systems in cell adhesion, proliferation and morphology; and finally, (vi) to investigate protein behaviour onto the surface of implanted materials. In the initial evaluation of protein adsorption onto SBB surfaces, single, binary and complex protein solutions were used. The distribution of the molecules was found to depend on the surface studied regardless of the protein specie. In single protein systems a preference for fibronectin and vitronectin adsorption in comparison to albumin was demonstrated, the laters adsorption potential was further decreased in competitive conditions. SPCL presented the highest protein adsorption levels. For the studied serum concentrations all the surfaces generally indicated good vitronectin adsorption. In the second part of this study, the effect of proteins on modulating leukocyte adhesion showed short and long-term effects in cell adhesion developed by vitronectin and albumin, respectively. The effect of oxygen-based plasma treatment on the different surfaces and the influence of proteins adsorption on modulating bone-cells behaviour were studied. Both SBB and PDLLA surface properties were affected by the selected surface modification technique, which increased albumin and fibronectin adsorption onto treated PDLLA. The crucial role of adsorbed proteins in mediating the response of osteogenic cells to the treated PDLLA surface was demonstrated. Regarding SBB surfaces, the absence of pre-incubated proteins showed to improve osteoblast-like cells proliferation onto plasma treated SPCL. Moreover, the pre-adsorbed proteins primarily defined MG63 cells morphology on SEVA-C surfaces, while on SPCL it was mainly affected by the plasma treatment. The correlation between the surface characteristics and protein adsorption isotherms from unitary and complex protein systems was investigated onto starch based materials. Albumin adsorption on SBB was affected by the material composition as well as by the concentration of the protein solution, preferentially adsorbing onto SCA and SPCL. Fibronectin adsorption reached higher values on SEVA-C and SPCL. There was no effect on the adsorption of albumin and fibronectin onto SPCL in competitive conditions. In the presence of albumin, fibronectin adsorption was reduced on SCA, while the opposite situation was observed for SEVA-C. Fibronectin demonstrated a different adsorption activity for the different materials as assessed by single and competitive adsorption with albumin. The adsorption/desorption study of plasma proteins on SBB surfaces was performed by multiloop Dynamic Contact Angle (DCA). In this study, the analysis of the hysteresis, advancing and receding wetting tensions indicated that adsorbed proteins could desorb more readily on SCA and SPCL than on SEVA-C. In the later case, stronger interactions such as hydrophobic forces were established, which could indicate the rearrangement of protein conformation. The physicochemical relationship between different biological molecules and SEVA-C was investigated in vivo. Results indicated that albumin and vitronectin were absent from the immediate tissue-implant interface and diffused into the bulk of the material. In contrast, fibronectin adsorption presented multilayer patterns that displaced fibrinogen from SEVA-C surfaces. In general, the adsorptive potential of albumin, fibronectin and vitronectin was characterized and SPCL surfaces showed increased adsorption levels for both unitary and complex protein systems. Protein distribution and desorption profiles were obtained and SEVA-C showed the lowest desorption ability. In vitro cell studies showed that PDLLA and SPCL were highly sensitive to the surface modification, and that cell response to SEVA-C was highly modulated by pre-adsorbed molecules. Finally, in vivo studies provided further insights into the dynamics established between different proteins and SEVA-C material. A importância atribuída à interacção entre células, proteínas e superfícies é geralmente considerada como um passo fundamental para a aplicação bem sucedida de qualquer biomaterial. Após o contacto com fluidos fisiológicos, muitas proteínas adsorvem às superfícies implantadas, induzindo a interacção indirecta das células com o material. Nas condições in vivo e in vitro é sabido que as células, geralmente, não interagem com as superfícies implantadas na ausência de biomoléculas. À semelhança de outros processos de interface, a quantidade, tipo e conformação das proteínas adsorvidas regulam a biointegração de um implante, definindo, assim, o seu resultado final: integração ou rejeição. O paradigma das interacções entre células e superfícies, que considera a adsorção de proteínas o primeiro acontecimento depois da existência de contacto e que determina os processos celulares consequentes, pode ser fulcral para o desenvolvimento de novas estratégias de biocompatibilidade e engenharia de tecidos. A adsorção de proteínas é considerada por muitos autores como um fenómeno dependente do material/superfície. Diversos estudos foram desenvolvidos com o intuito de atingir um compromisso perfeito entre material e biocompatibilidade através da manipulação do comportamento das proteínas nas superfícies. Do ponto de vista funcional, o estudo qualitativo e quantitativo da afinidade de proteínas a superfícies é essencial na avaliação dos mecanismos posteriores às interacções célula-superfície permitindo, deste modo, melhorar as propriedades de biomateriais implantados. Os materiais utilizados neste trabalho foram estudados para diversas aplicações na área da biomedicina, designadamente, misturas de amido de milho com acetato de celulose (SCA) etileno álcool-vinílico (SEVA-C) e policaprolactona (SPCL); SCA com hidroxiapatite (SCA+10%HA); e poli-D,L-ácido láctico (PDLLA). Os materiais à base de amido de milho e o PDLLA demonstraram, tanto in vivo com in vitro, um comportamento biocompatível. Embora vários estudos de biologia celular tenham sido efectuados, o efeito da adsorção de biomoléculas com relevância clínica nas interacções entre células e superfícies ainda não é totalmente conhecido. Neste contexto, foi delineado um plano de trabalhos, que deu origem a esta tese, com o objectivo de avaliar diferentes aspectos da interacção entre proteínas, células e superfícies dos materiais, nomeadamente: (i) a distribuição de proteínas nas superfícies em estudo, (ii) o efeito da química de superfícies na adsorção proteíca, (iii) a cinética de adsorção de proteínas, (iv) aspectos de competição, troca e desadsorção de biomoléculas, (v) a influência das proteínas na adesão, proliferação e morfologia celulares, e finalmente, (vi) o comportamento de moléculas na interface implante-tecido. Numa fase inicial da avaliação da adsorção de proteínas foram utilizadas soluções proteicas simples, binárias e complexas. Concluiu-se que a distribuição das moléculas depende da superfície em estudo, e não do tipo de proteínas utilizadas. Em sistemas proteicos simples verificou-se a preferência pela adsorção da fibronectina e vitronectina em comparação com a albumina, cujo potencial de adsorção diminui em condições competitivas. Os níveis mais altos de adsorção de proteínas foram obtidos pelo SPCL. Todas as superfícies demonstraram, em termos gerais, uma boa adsorção de vitronectina nas concentrações de soro estudadas. Numa segunda fase deste estudo, a influência das proteínas na adesão de leucócitos apresentou efeitos a curto e a longo prazo na adesão celular desenvolvidas, respectivamente, pela vitronectina e albumina. Foi ainda estudado o efeito do tratamento por plasma de oxigénio nas diferentes superfícies e a influência da adsorção de proteínas no comportamento das células do osso. As propriedades do PDLLA e dos materiais à base de amido de milho foram modificadas pela técnica seleccionada, resultando no aumento de adsorção de albumina e de fibronectina nas superfícies de PDLLA. Demonstrou-se também a função essencial das proteínas adsorvidas na resposta celular ao PDLLA modificado por plasma. Relativamente aos materiais à base de amido de milho, a ausência de proteínas pré-adsorvidas melhorou a proliferação de osteoblastos nas superfícies de SPCL modificadas. Além disso, as proteínas pré-adsorvidas influenciaram a morfologia das células MG63 nas superfícies de SEVA-C, enquanto que no SPCL as maiores alterações resultaram do tratamento por plasma. A relação entre as características das superfícies dos materiais à base de amido de milho e a adsorção de proteína foi estudada usando soluções proteícas simples e complexas. A adsorção de albumina foi influenciada pela composição dos materiais e pela concentração da solução proteíca, adsorvendo preferencialmente às superfícies de SCA e de SPCL. Por outro lado, a adsorção de fibronectina atingiu valores mais elevados na superfície de SEVA-C e de SPCL. Em condições competitivas nenhum efeito foi observado na adsorção da albumina e fibronectina ao SPCL. Na presença da albumina, a afinidade da fibronectina ao SCA diminuiu, enquanto que o contrário foi observado para o SEVA-C. Verificou-se que o comportamento da fibronectina na presença de albumina em condições competitivas difere do demonstrado em sistemas unitários. A adsorção/desadsorção de proteínas do plasma sanguíneo aos materiais à base de amido de milho foi estudada utilizando a técnica de Ângulo de Contacto Dinâmico. Neste estudo, a análise da histerese e das tensões de molhabilidade indicou que a desadsorção das proteínas é mais rápida nas superfícies de SCA e de SPCL do que nas de SEVA-C. Neste último material, estabeleceram-se interacções mais fortes (ligações hidrofóbicas), o que pode indicar o rearranjo da conformação proteíca. A relação físico-química entre as diferentes biomoléculas e as misturas poliméricas de SEVA-C foi estudada in vivo. Os resultados obtidos demonstraram a ausência de albumina e vitronectina na interface tecido-implante e a sua difusão no interior do material. Por outro lado, a fibronectina adsorveu em padrões de multicamadas, deslocando o fibrinogénio da superfície dos materiais implantados. Em termos gerais, o potencial de adsorção da albumina, fibronectina e vitronectina foi caracterizado. Nas superfícies de SPCL observaram-se os níveis mais elevados de adsorção utilizando sistemas proteicos unitários ou complexos. A distribuição das proteínas e os perfis de adsorção foram estudados e verificou-se que a mistura de SEVA-C apresenta menor capacidade de desadsorção. No que respeita aos estudos celulares, concluiu-se que o PDLLA e o SPCL foram os materiais mais afectados pelo tratamento por plasma e que o SEVA-C foi o material mais influenciado pela pré-adsorção de proteínas. Por último, os estudos in vivo permitiram aprofundar os conhecimentos sobre a dinâmica estabelecida entre diferentes proteínas e o SEVA-C. Tese de Doutoramento em Engenharia Biomédica
Document Type
Doctoral Thesis
Language English
Advisor(s) Reis, R. L.; Hunt, J. A.
Language English
Advisor(s) Reis, R. L.; Hunt, J. A.
