Author(s):
Guimarães, Pedro M. R. 
Date: 2008
Persistent ID: http://hdl.handle.net/1822/8608
Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
Subject(s): Levedura de cerveja; Transporte de maltose; Ergosterol; Carga energética; Soro do queijo; Fermentação de lactose; Bio-etanol; Saccharomyces cerevisiae recombinante; Evolução dirigida; Ensaios de transporte de açúcar; Brewer’s yeast; Maltose transport; Ergosterol; Adenylate energy charge; Cheese whey; Lactose fermentation; Bio-ethanol; Kluyveromyces lactis; Recombinant Saccharomyces cerevisiae; Evolutionary engineering; Sugar uptake assays; 663.12
Description
This thesis is focused on physiological aspects of the yeasts used in two alcoholic
fermentation processes: primary brewing fermentation and fermentation of lactose
(particularly lactose derived from cheese whey) to ethanol by recombinant Saccharomyces
cerevisiae flocculent strains.
The brewing fermentation is probably the most extensively studied alcoholic fermentation
process. Nevertheless, developments in brewing technology demand deeper understanding
of yeast physiology under process conditions. The studies with brewer’s yeast reported in this
thesis addressed two specific questions that had not yet been effectively investigated. First, it
is here directly demonstrated for the first time that the brewer’s yeast lipid composition,
particularly the amounts of sterols and unsaturated fatty acids, affects the activity of maltose
transporters. The maltose uptake rates were correlated with the amount of ergosterol in yeast,
showing that proper function of the maltose permeases requires adequate amounts of
ergosterol in the plasma membrane. This effect may partly explain the low maltose (and
maltotriose) transport rates at the beginning and during the second half of brewery
fermentations, when the sterol content of the yeast is low. Second, the energetic state of the
yeast was studied under the specific environments of high- and very high-gravity brewing
fermentations. The adenylate energy charge (EC) of the yeast was high (>0.8) throughout
fermentation until residual sugar concentrations became low and specific rates of ethanol
production became less than 5% of the maximum values observed in early fermentation. At
that point, the EC fell to around 0.5 – 0.6. The results suggest that the ethanol tolerance of
brewer’s yeast is high so long as fermentation continues. However, when residual α-glucoside
concentrations no longer support adequate rates of fermentation both the EC and the yeast
viability collapse.
The development of microorganisms that efficiently ferment lactose has a high
biotechnological value for the design of processes for the bioremediation of cheese whey with
simultaneous production of bio-ethanol. A new lactose-fermenting flocculent S. cerevisiae
recombinant strain is described here. This strain (T1-E) was obtained by evolutionary
engineering of an original recombinant (T1, constructed in previous work) that had shown
rather poor lactose fermentation and flocculation performances. The new strain T1-E
consumed lactose 2-fold faster producing 30% more ethanol than T1. Its flocculation
performance was also significantly better than that of T1. A series of physiological and genetic studies were done to compare T1 and T1-E. The contribution of the identified molecular
differences to the improved lactose fermentation phenotype of strain T1-E is discussed. In
batch fermentations with mineral medium, the new strain T1-E consumed rapidly and
completely lactose at initial concentrations up to 150 g•L-1. The maximum ethanol titre
reached was 8% (v/v) and the highest ethanol productivity was 1.5 – 2 g•L-1•h-1. T1-E was
also able to ferment 3-fold concentrated cheese whey (about 150 g•L-1 of lactose), producing
7% (v/v) of ethanol. These results demonstrate that T1-E is the most efficient lactosefermenting
S. cerevisiae recombinant strain reported in the literature. Being highly flocculent,
this strain is suitable for developing high cell density fermentation systems that, when
operated in continuous with flocculated biomass retention, can reach very high productivities.
Sugar transport is a key factor determining fermentation efficiency in both processes studied
in this thesis. Studies of lactose transport by the recombinant S. cerevisiae strains (T1 and
T1-E) and by Kluyveromyces lactis revealed that zero-trans uptake rates of lactose measured
by standard methodology (i.e. using suspensions of yeast harvested from fermentation,
washed and stored in nutrient-free buffer at low temperature before they are assayed using
radiolabeled sugar) were too small (by factors of 3 to 8) to account for the lactose
consumption rates observed during fermentations. A short incubation (1 – 7 min) with glucose
(10 – 30 mM) increased the low intracellular ATP and EC of cells in the starved yeast
suspensions to the levels found in actively fermenting yeast cells, and simultaneously
increased the activity (Vmax) of the lactose transporters by factors of 1.5 to 5. Similar
observations were made for maltose transport in brewer’s yeasts. These results suggest that
the electrochemical proton potential that drives transport through sugar/H+ symports is
significantly smaller in the starved yeast suspensions used for the zero-trans assays than in
actively metabolising cells. Short exposure of the starved cells to glucose is suggested as a
quick method to approach more closely the sugar/H+ symport capacity of the actively
fermenting cells. Esta tese foca-se em aspectos relacionados com a fisiologia de leveduras utilizadas em dois
processos de fermentação alcoólica: a fermentação primária da cerveja e a fermentação de
lactose (em particular a lactose derivada do soro do queijo) para produção de etanol por
estirpes floculantes de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificadas.
A fermentação da cerveja é provavelmente o processo de fermentação alcoólica mais
extensivamente estudado. Todavia, o desenvolvimento da tecnologia para o fabrico de
cerveja requer uma compreensão mais aprofundada da fisiologia da levedura nas condições
específicas deste processo. Os estudos com levedura de cerveja descritos nesta tese
abordaram duas questões específicas que não haviam ainda sido efectivamente
investigadas. Em primeiro lugar, é aqui demonstrado pela primeira vez que a composição
lipídica da levedura de cerveja, em particular o seu conteúdo em esteróis e ácidos gordos
insaturados, afecta a actividade dos transportadores de maltose. Verificou-se uma relação
entre as taxas de transporte de maltose e a quantidade de ergosterol na levedura,
demonstrando que o funcionamento adequado das permeases da maltose requer
quantidades adequadas de ergosterol na membrana plasmática. Este efeito poderá explicar
parcialmente as baixas taxas de transporte de maltose (e maltotriose) no início e durante a
segunda metade das fermentações de cerveja, fases em que o conteúdo de esteróis da
levedura é baixo. Em segundo lugar, o estado energético da levedura foi estudado nas
condições específicas de fermentações de cerveja com mostos de alta e muito alta
gravidade. A carga energética (EC) da levedura foi elevada (>0.8) durante a fermentação até
a concentração residual de açúcar se tornar baixa e as taxas específicas de produção de
etanol baixarem para menos de 5% dos valores máximos observados na fase inicial da
fermentação. Nesse ponto, a EC decaiu para cerca de 0.5 – 0.6. Os resultados sugerem que
a tolerência da levedura de cerveja ao etanol é elevada enquanto a fermentação prosseguir.
No entanto, quando as concentrações residuais de α-glucosídeos não mais sustentam taxas
de fermentação adequadas tanto a EC como a viabilidade da levedura colapsam.
O desenvolvimento de microrganismos que fermentem de forma eficiente a lactose tem um
elevado valor em termos biotecnológicos para o desenho de processos para a
biorremediação do soro do queijo com produção de bio-etanol em simultâneo. Uma nova
estirpe recombinante de S. cerevisiae capaz de fermentar a lactose e floculante é descrita
nesta tese. Esta estirpe (T1-E) foi obtida por evolução dirigida a partir de uma estirpe
recombinante original (T1, construída em trabalho prévio) que havia demonstrado um fraco
desempenho em termos de fermentação de lactose e de floculação. A nova estirpe, T1-E, foi capaz de consumir a lactose duas vezes mais rapidamente e de produzir 30% mais etanol do
que a estirpe T1. Foram efectuados vários estudos fisiológicos e genéticos para comparar as
estirpes T1 e T1-E. A contribuição das diferenças identificadas ao nível molecular para o
fenótipo melhorado da estirpe T1-E em termos de fermentação de lactose é aqui discutida.
Em fermentações descontínuas com meio mineral, a nova estirpe T1-E consumiu
rapidamente e por completo lactose em concentrações iniciais até 150 g•L-1. A concentração
máxima de etanol atingida foi 8% (v/v) e a produtividade máxima foi 1.5 – 2 g•L-1•h-1. A estirpe
T1-E foi também capaz de fermentar soro do queijo três vezes concentrado (cerca de 150
g•L-1 de lactose), produzindo 7% (v/v) de etanol. Estes resultados demonstram que a estirpe
T1-E é a estirpe recombinante de S. cerevisiae mais eficiente para fermentação de lactose
descrita na literatura. Sendo floculante, esta estirpe é adequada para desenvolver sistemas
de fermentação de alta densidade celular que, quando operados em continuo com retenção
da biomassa floculada, permitem atingir produtividades muito elevadas.
O transporte de açúcares é um factor chave na determinação da eficiência de fermentação
em ambos os processos estudados nesta tese. Estudos do transporte de lactose nas estirpes
recombinantes de S. cerevisiae (T1 e T1-E) e em Kluyveromyces lactis revelaram que as
taxas iniciais de transporte de lactose medidas pela metodologia padrão (i.e. usando
suspensões de leveduras colhidas da fermentação, lavadas e guardadas em tampão sem
nutrientes a baixa temperatura antes de serem utilizadas para ensaios com açúcar marcado
radioactivamente) eram demasiado baixas (por factores de 3 a 8) para explicar as taxas de
consumo de lactose observadas durante as fermentações. Uma breve incubação (1 – 7 min)
com glucose (10 – 30 mM) aumentou a baixa EC e os baixos níveis de ATP intracelulares
encontrados nas suspensões de leveduras guardadas sem nutrientes para os níveis
encontrados em células de leveduras a fermentar activamente. Simultaneamente, essa
incubação aumentou a actividade (Vmax) dos transportadores de lactose por factores de 1.5 a
5. Foram feitas observações semelhantes para o transporte de maltose em leveduras de
cerveja. Estes resultados sugerem que o potencial electroquímico de protões responsável
pelo transporte por mecanismos de simporte açúcar-protão é significativamente mais
reduzido nas células guardadas em tampão sem nutrientes, utilizadas para os ensaios de
transporte, do que nas células a fermentar activamente. Um breve tratamento das células
guardadas sem nutrientes com glucose é sugerido como um método rápido para abordar de
forma mais aproximada a capacidade dos sistemas de simporte açúcar-protão das leveduras
a fermentar activamente. Tese de Doutoramento em Engenharia Química e Biológica Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - SFRH/BD/13463/2003.
