Author(s):
Oliveira, Joaquim M. 
Date: 2009
Persistent ID: http://hdl.handle.net/1822/9527
Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
Subject(s): 61:620.1; 620.1:61; 611-018
Document details
New nanotechnology approaches using dendrimers modified with natural polymers f...
Description
In the recent years, great progress has been done in the emerging field of tissue engineering. Despite the important advances the performance of cells-scaffold constructs, one of the several tissue engineering approaches, remains limited in part due to the need for optimize cell culture techniques and culture media. Nanocarrier systems have generated a significant amount of interest in the ex vivo cell maintenance, and control of the cellular fate in vivo mainly due to their internalization efficiency, drug loading capacity, and to favorably modulate the solubility and pharmacokinetics of drugs. Dendrimers are synthetic, monodispersive, spherical and highly branched macromolecules that present unique advantages and fulfills most requirements as carriers for drug delivery; however, it has been found that high generation dendrimers are often cytotoxic. Thus, in this thesis we focused our attention in this fundamental problem and explore the development of novel nanobiomaterials based on the grafting of carboxymethylchitosan (CMCht) onto low generation poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers, the socalled CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles. These macromolecular vehicles were developed to explore a new concept consisting on the intracellular and controlled delivery of bioactive molecules aimed at control stem cells functions in a more effective manner ex vivo, and maintain the cellular phenotype in vivo upon re-implantation. Thus, by combining nanotechnology-based systems and traditional tissue engineering strategies, we expect to develop a novel therapeutic solution for the efficient treatment of damage/diseased cells and tissues. To validate this new concept, there is the need to evaluate the performance of the developed nanocarriers, in vitro and in vivo. Firstly, the uptake efficiency and internalization mechanism of fluorescent-labeled CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles was investigated using different cell types. Fluorescence microscopy studies revealed that the developed nanocarriers could be efficiently internalized, either by cell lines and primary cultures, after a few hours. Flow cytometry studies revealed that rat bone marrow stromal cells (RBMSCs) cultured in the presence of colchicine, an alkaloid that inhibits endocytosis, decreased the internalization of the nanoparticles. These data showed that uptake by cells was primarily via an active endocytotic mechanism, but not exclusively. Preliminary studies were also carried out to evaluate the possible applicability of the CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles in the central nervous system. Internalization rate, cell viability and metabolic activity studies were performed using rat post-natal hippocampal neurons and cortical glial cells that revealed their ability for being taken up by these cells and its non cytotoxicity. Complementarily, dexamethasone (Dex), a glucocorticoid known to have important role on the proliferation and expression of osteoblastic differentiation markers, was used as a model drug and incorporated into the bulk of the nanoparticles. Physicochemical characterization and in vitro biological studies have demonstrated that the Dex-loaded CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles were successfully synthesized, were not cytotoxic in the range of concentration below 1 mg.mL-1 and promote osteogenesis (2-D system). To assess the true value of the Dex-loaded CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles systems for application in tissue engineering strategies, we use different biomaterials to develop a set of novel scaffolds both ceramic and polymeric or formulations. These scaffolds were found to be suitable for applications in bone, cartilage and osteochondral tissue engineering. In vitro studies have shown that combination of scaffolds, bone marrow stromal cells and Dex-loaded CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles (3-D system) enhanced osteogenesis. Finally, in vivo studies have shown that the novel Dex-loaded CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles may be beneficial as intracellular nanocarrier, supplying Dex in a regimented manner, while avoiding the need of culturing stem cells for long periods of time in vitro, towards promoting the osteogenic differentiation. Remarkably, the proposed strategy allow modulate and direct stem cells differentiation towards osteogenic phenotype, enhance in vivo proteoglycan extracellular matrix synthesis and promote superior de novo bone formation. This thesis mark the transition from the ‘proof-of-concept’ to useful intracellular nanocarrier tool, as the Dex-loaded CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles show promise for application in direct stem cell to a particular cell fate, in vitro and in vivo. Grandes progressos têm sido feitos nos últimos tempos no emergente campo científico da engenharia de tecidos. No entanto, a eficiência dos sistemas células-matriz tridimensional porosa, uma das estratégias usadas nas abordagens em engenharia de tecidos, tem sido limitada, em parte, pela necessidade de se optimizarem as técnicas e os meios de cultura usados. Sistemas de nanopartículas para o transporte de moléculas bioactivas têm suscitado grande interesse na área da biomedicina, nomeadamente no que respeita à possível aplicação como suplementos em meios de cultura ex vivo, e no controlo das funções celulares in vivo. Isto deve-se, principalmente, à sua eficiência de internalização, elevada capacidade de incorporação de fármacos, e ao facto de favorecerem a solubilidade de moléculas hidrofóbicas e de possibilitarem a modulação da sua farmacocinética. Os dendrímeros são sistemas macromoleculares sintéticos altamente ramificados que apresentam características únicas, tais como monodispersividade e uma estrutura esférica, e que preenchem a maioria dos requisitos para serem usados como veículos para a libertação controlada de fármacos. Não obstante, tem-se verificado que dendrímeros de elevada geração apresentam tipicamente uma citotoxicidade indesejada. Assim, nesta tese a atenção focou-se na resolução deste problema fundamental. Para tal foi explorado o desenvolvimento de novos nanobiomateriais tendo como estratégia a ligação química do polímero carboximetilquitosano (CMCht) a dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) de baixa geração, que se denominaram por nanopartículas de carboximetilquitosano/poliamidoamina (CMCht/PAMAM). Estas macromoléculas foram desenvolvidas e um novo conceito aplicativo foi testado relacionado com a sua aplicação em medicina regenerativa como veículos de libertação controlada e intracelular de moléculas bioactivas, de forma a ser possível controlar efectivamente as actividades celulares, tais como a proliferação e a diferenciação de células estaminais ex vivo, e a manutenção do fenótipo dessas mesmas células após o seu implante. Assim, recorrendo à nanotecnologia e a estratégias usadas na engenharia de tecidos, espera-se que seja possível desenvolver uma nova solução terapêutica que possa possibilitar, de uma forma eficiente, o tratamento de células e tecidos danificados ou que apresentem algum tipo de patologia. De forma a validar este novo conceito, é necessário avaliar o potencial dos nanosistemas desenvolvidos, in vitro e in vivo. Primeiramente, a eficiência e o mecanismo de internalização de nanopartículas de CMCht/PAMAM ligadas a um marcador fluorescente foram investigados, recorrendo a estudos celulares, in vitro. Estudos de microscopia de fluorescência revelaram que as nanopartículas desenvolvidas são internalizadas por diferentes tipos de células após algumas horas em cultura, incluindo linhas celulares e culturas primárias. Estudos envolvendo a citometria de fluxo mostraram que quando células multipotentes do estroma da medula óssea de rato (RBMSCs), foram cultivadas na presença de colchicina, um alcalóide inibidor da endocitose, exibiam menor capacidade de internalização das nanopartículas. Assim, a internalização das nanopartículas pelas células ocorre principalmente por um mecanismo de endocitose, mas que este não é o único. Foram também realizados estudos para determinar a taxa de internalização, viabilidade celular e actividade metabólica, recorrendo a neurónios isolados do hipocampo de rato pós-natais e células da glia. Estes estudos mostraram que as nanopartículas são internalizadas por estas células, e não afectam negativamente a viabilidade da cultura das células. A dexametasona (Dex), uma molécula pertencente à família dos glucocorticóides e conhecida pelo seu papel na modulação da proliferação e expressão dos marcadores de diferenciação osteoblástica, foi usada como fármaco modelo e incorporada nas nanopartículas de CMCht/PAMAM. A caracterização físico-química e estudos biológicos in vitro demonstraram que as nanopartículas de CMCht/PAMAM carregadas com Dex foram sintetizadas com sucesso, não apresentaram citotoxicidade em concentrações até 1 mg.mL-1 e promoveram a osteogénese (sistema de cultura 2-D). Por forma a avaliar o verdadeiro potencial aplicativo das nanopartículas de CMCht/PAMAM carregadas com Dex em estratégias de engenharia de tecidos, diferentes biomateriais foram usados no desenvolvimento de estruturas tridimensionais porosas, incluindo cerâmicos, polímeros e formulações contendo ambos. Estas estruturas tridimensionais porosas mostraram-se adequadas para serem usadas em engenharia de tecidos de osso, cartilagem e defeitos osteocondrais. Estudos in vitro revelaram que a abordagem constituída por estruturas tridimensionais porosas, RBMSCs e nanopartículas de CMCht/PAMAM carregadas com Dex (sistema de cultura 3-D) promoveu um aumento significativo da osteogénese. Por último, estudos in vivo mostraram que as nanopartículas de CMCht/PAMAM carregadas com Dex são um sistema de libertação intracelular altamente eficiente, uma vez que possibilitaram a libertação de Dex com um perfil cinético adequado, permitindo assim evitar os longos períodos de cultura in vitro, necessários à diferenciação osteogénica de células estaminais. A estratégia proposta permite modular e direccionar a diferenciação das células estaminais para o fenótipo osteogénico, aumentar a síntese de proteoglicanos da matriz extracelular e promover a formação de osso num estado de maturação mais avançado. Esta tese marca a transição de “prova de conceito” para uma ferramenta aplicativa das nanopartículas desenvolvidas na libertação intracelular de fármacos, uma vez que as nanopartículas de CMCht/PAMAM carregadas com Dex se mostraram promissoras no direccionamento das células estaminais para um determinado fenótipo, in vitro e in vivo. Tese de doutoramento em Ciência e Tecnologia de Materiais (ramo de conhecimento em Engenharia de Tecidos - Materiais Híbridos) Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - ref. SFRH/BD/21786/2005 através dos programas POCTI e FEDER Rotary Club de Caldas das Taipas Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) - PhD grant Ref. SFRH/BD/21786/2005, POCTI, FEDER programs Canon Foundation in Europe European NoE EXPERTISSUES (NMP3-CT-2004-500283) European Union HIPPOCRATES STREP Project (NMP3-CT-2003-505758)
In the recent years, great progress has been done in the emerging field of tissue engineering. Despite the important advances the performance of cells-scaffold constructs, one of the several tissue engineering approaches, remains limited in part due to the need for optimize cell culture techniques and culture media. Nanocarrier systems have generated a significant amount of interest in the ex vivo cell maintenance, and control of the cellular fate in vivo mainly due to their internalization efficiency, drug loading capacity, and to favorably modulate the solubility and pharmacokinetics of drugs. Dendrimers are synthetic, monodispersive, spherical and highly branched macromolecules that present unique advantages and fulfills most requirements as carriers for drug delivery; however, it has been found that high generation dendrimers are often cytotoxic. Thus, in this thesis we focused our attention in this fundamental problem and explore the development of novel nanobiomaterials based on the grafting of carboxymethylchitosan (CMCht) onto low generation poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers, the socalled CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles. These macromolecular vehicles were developed to explore a new concept consisting on the intracellular and controlled delivery of bioactive molecules aimed at control stem cells functions in a more effective manner ex vivo, and maintain the cellular phenotype in vivo upon re-implantation. Thus, by combining nanotechnology-based systems and traditional tissue engineering strategies, we expect to develop a novel therapeutic solution for the efficient treatment of damage/diseased cells and tissues. To validate this new concept, there is the need to evaluate the performance of the developed nanocarriers, in vitro and in vivo. Firstly, the uptake efficiency and internalization mechanism of fluorescent-labeled CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles was investigated using different cell types. Fluorescence microscopy studies revealed that the developed nanocarriers could be efficiently internalized, either by cell lines and primary cultures, after a few hours. Flow cytometry studies revealed that rat bone marrow stromal cells (RBMSCs) cultured in the presence of colchicine, an alkaloid that inhibits endocytosis, decreased the internalization of the nanoparticles. These data showed that uptake by cells was primarily via an active endocytotic mechanism, but not exclusively. Preliminary studies were also carried out to evaluate the possible applicability of the CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles in the central nervous system. Internalization rate, cell viability and metabolic activity studies were performed using rat post-natal hippocampal neurons and cortical glial cells that revealed their ability for being taken up by these cells and its non cytotoxicity. Complementarily, dexamethasone (Dex), a glucocorticoid known to have important role on the proliferation and expression of osteoblastic differentiation markers, was used as a model drug and incorporated into the bulk of the nanoparticles. Physicochemical characterization and in vitro biological studies have demonstrated that the Dex-loaded CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles were successfully synthesized, were not cytotoxic in the range of concentration below 1 mg.mL-1 and promote osteogenesis (2-D system). To assess the true value of the Dex-loaded CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles systems for application in tissue engineering strategies, we use different biomaterials to develop a set of novel scaffolds both ceramic and polymeric or formulations. These scaffolds were found to be suitable for applications in bone, cartilage and osteochondral tissue engineering. In vitro studies have shown that combination of scaffolds, bone marrow stromal cells and Dex-loaded CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles (3-D system) enhanced osteogenesis. Finally, in vivo studies have shown that the novel Dex-loaded CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles may be beneficial as intracellular nanocarrier, supplying Dex in a regimented manner, while avoiding the need of culturing stem cells for long periods of time in vitro, towards promoting the osteogenic differentiation. Remarkably, the proposed strategy allow modulate and direct stem cells differentiation towards osteogenic phenotype, enhance in vivo proteoglycan extracellular matrix synthesis and promote superior de novo bone formation. This thesis mark the transition from the ‘proof-of-concept’ to useful intracellular nanocarrier tool, as the Dex-loaded CMCht/PAMAM dendrimer nanoparticles show promise for application in direct stem cell to a particular cell fate, in vitro and in vivo. Grandes progressos têm sido feitos nos últimos tempos no emergente campo científico da engenharia de tecidos. No entanto, a eficiência dos sistemas células-matriz tridimensional porosa, uma das estratégias usadas nas abordagens em engenharia de tecidos, tem sido limitada, em parte, pela necessidade de se optimizarem as técnicas e os meios de cultura usados. Sistemas de nanopartículas para o transporte de moléculas bioactivas têm suscitado grande interesse na área da biomedicina, nomeadamente no que respeita à possível aplicação como suplementos em meios de cultura ex vivo, e no controlo das funções celulares in vivo. Isto deve-se, principalmente, à sua eficiência de internalização, elevada capacidade de incorporação de fármacos, e ao facto de favorecerem a solubilidade de moléculas hidrofóbicas e de possibilitarem a modulação da sua farmacocinética. Os dendrímeros são sistemas macromoleculares sintéticos altamente ramificados que apresentam características únicas, tais como monodispersividade e uma estrutura esférica, e que preenchem a maioria dos requisitos para serem usados como veículos para a libertação controlada de fármacos. Não obstante, tem-se verificado que dendrímeros de elevada geração apresentam tipicamente uma citotoxicidade indesejada. Assim, nesta tese a atenção focou-se na resolução deste problema fundamental. Para tal foi explorado o desenvolvimento de novos nanobiomateriais tendo como estratégia a ligação química do polímero carboximetilquitosano (CMCht) a dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) de baixa geração, que se denominaram por nanopartículas de carboximetilquitosano/poliamidoamina (CMCht/PAMAM). Estas macromoléculas foram desenvolvidas e um novo conceito aplicativo foi testado relacionado com a sua aplicação em medicina regenerativa como veículos de libertação controlada e intracelular de moléculas bioactivas, de forma a ser possível controlar efectivamente as actividades celulares, tais como a proliferação e a diferenciação de células estaminais ex vivo, e a manutenção do fenótipo dessas mesmas células após o seu implante. Assim, recorrendo à nanotecnologia e a estratégias usadas na engenharia de tecidos, espera-se que seja possível desenvolver uma nova solução terapêutica que possa possibilitar, de uma forma eficiente, o tratamento de células e tecidos danificados ou que apresentem algum tipo de patologia. De forma a validar este novo conceito, é necessário avaliar o potencial dos nanosistemas desenvolvidos, in vitro e in vivo. Primeiramente, a eficiência e o mecanismo de internalização de nanopartículas de CMCht/PAMAM ligadas a um marcador fluorescente foram investigados, recorrendo a estudos celulares, in vitro. Estudos de microscopia de fluorescência revelaram que as nanopartículas desenvolvidas são internalizadas por diferentes tipos de células após algumas horas em cultura, incluindo linhas celulares e culturas primárias. Estudos envolvendo a citometria de fluxo mostraram que quando células multipotentes do estroma da medula óssea de rato (RBMSCs), foram cultivadas na presença de colchicina, um alcalóide inibidor da endocitose, exibiam menor capacidade de internalização das nanopartículas. Assim, a internalização das nanopartículas pelas células ocorre principalmente por um mecanismo de endocitose, mas que este não é o único. Foram também realizados estudos para determinar a taxa de internalização, viabilidade celular e actividade metabólica, recorrendo a neurónios isolados do hipocampo de rato pós-natais e células da glia. Estes estudos mostraram que as nanopartículas são internalizadas por estas células, e não afectam negativamente a viabilidade da cultura das células. A dexametasona (Dex), uma molécula pertencente à família dos glucocorticóides e conhecida pelo seu papel na modulação da proliferação e expressão dos marcadores de diferenciação osteoblástica, foi usada como fármaco modelo e incorporada nas nanopartículas de CMCht/PAMAM. A caracterização físico-química e estudos biológicos in vitro demonstraram que as nanopartículas de CMCht/PAMAM carregadas com Dex foram sintetizadas com sucesso, não apresentaram citotoxicidade em concentrações até 1 mg.mL-1 e promoveram a osteogénese (sistema de cultura 2-D). Por forma a avaliar o verdadeiro potencial aplicativo das nanopartículas de CMCht/PAMAM carregadas com Dex em estratégias de engenharia de tecidos, diferentes biomateriais foram usados no desenvolvimento de estruturas tridimensionais porosas, incluindo cerâmicos, polímeros e formulações contendo ambos. Estas estruturas tridimensionais porosas mostraram-se adequadas para serem usadas em engenharia de tecidos de osso, cartilagem e defeitos osteocondrais. Estudos in vitro revelaram que a abordagem constituída por estruturas tridimensionais porosas, RBMSCs e nanopartículas de CMCht/PAMAM carregadas com Dex (sistema de cultura 3-D) promoveu um aumento significativo da osteogénese. Por último, estudos in vivo mostraram que as nanopartículas de CMCht/PAMAM carregadas com Dex são um sistema de libertação intracelular altamente eficiente, uma vez que possibilitaram a libertação de Dex com um perfil cinético adequado, permitindo assim evitar os longos períodos de cultura in vitro, necessários à diferenciação osteogénica de células estaminais. A estratégia proposta permite modular e direccionar a diferenciação das células estaminais para o fenótipo osteogénico, aumentar a síntese de proteoglicanos da matriz extracelular e promover a formação de osso num estado de maturação mais avançado. Esta tese marca a transição de “prova de conceito” para uma ferramenta aplicativa das nanopartículas desenvolvidas na libertação intracelular de fármacos, uma vez que as nanopartículas de CMCht/PAMAM carregadas com Dex se mostraram promissoras no direccionamento das células estaminais para um determinado fenótipo, in vitro e in vivo. Tese de doutoramento em Ciência e Tecnologia de Materiais (ramo de conhecimento em Engenharia de Tecidos - Materiais Híbridos) Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - ref. SFRH/BD/21786/2005 através dos programas POCTI e FEDER Rotary Club de Caldas das Taipas Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) - PhD grant Ref. SFRH/BD/21786/2005, POCTI, FEDER programs Canon Foundation in Europe European NoE EXPERTISSUES (NMP3-CT-2004-500283) European Union HIPPOCRATES STREP Project (NMP3-CT-2003-505758)
Document Type
Doctoral Thesis
Language English
Advisor(s) Reis, R. L.; Mano, J. F.; Ohgushi, Hajime
Language English
Advisor(s) Reis, R. L.; Mano, J. F.; Ohgushi, Hajime
