Author(s):
Santos, Sílvia Gonzaga da Silva 
Date: 2009
Persistent ID: http://hdl.handle.net/1822/9866
Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
Subject(s): 618.33; 616-056.7; 616-07
Document details
Modulation of lung development by In utero gene transfer
Description
Advances in prenatal diagnosis of genetic and congenital disorders with progressively more sensitive techniques may increase opportunities for consideration of prenatal gene therapy. There are a number of genetic and acquired disorders with peri or postnatal pulmonary manifestations. These include monogenetic diseases like cystic fibrosis or surfactant protein B deficiency that would presumably require long-term expression of the deficient or defective gene. However, there are also abnormalities of lung growth, such as congenital diaphragmatic hernia, or lung maturation, such as respiratory distress syndrome of prematurity, that could potentially benefit from strategies that achieve transient gene expression in specific pulmonary distributions. Considered an attractive target organ for fetal gene transfer, the developing lung, poses also some obstacles that would only be overcomed with the development of a variety of gene transfer methodologies: different types of vector, optimal site, route and timing of gene delivery. The fundament of this dissertation was to modulate lung growth/maturation by in utero gene transfer, aiming to unveil underlying mechanisms of normal and abnormal lung development. The first objective of this dissertation was to develop a new approach of gene transfer targeting the fetal lung in early stages of lung development. We developed a new method for direct injection of viral vectors into the rat fetal lung as early as the pseudoglandular phase of lung development using ultrasound guided microinjections. The pseudoglandular stage, characterized by intense branching morphogenesis, is the period of greatest overall growth of the airways and vasculature of the fetal lung and corresponds to a stage of immunologic immaturity. Therefore, gene transfer during this period has the potential to have major effects on key elements of lung growth with minimal potential for detrimental immune responses. We aimed to compare two distinct types of vectors: an adenoviral vector and a lentiviral vector (equine infectious anemia virus-based), both expressing the enhanced green fluorescent protein reporter gene. This study confirmed that adenoviral vectors are more suitable when rapid, high-level and transient expression of the transgene is required; whereas lentiviral vectors are more appropriate to induce sustained and long-term expression. One of the concerns in gene transfer protocols is to target a specific cellular compartment of a determined organ/system. Interestingly, interstitial compartment rather than epithelial cells were transduced in opposition to previous studies describing intrapulmonary, intraamniotic and intratracheal administrations of viral vectors. The observation of transduction of distinct cell populations within the lung with different routes of transduction raises the possibility of manipulating gene expression in specific and separate cell populations within the developing lung. We then decided to use this model system to perform an in vivo study of dynamic lung morphogenesis, involving a major player in branching morphogenesis, fibroblast growth factor 10 (FGF10). We observed that FGF10 mesenchymal overexpression, on the fetal rat lung, resulted in the induction of consistent patterns of malformation, the appearance of which were developmental stage and location dependent. These malformations, in total, appear to closely recapitulate the morphology and histology of the entire spectrum of human Congenital Cystic Adenomatoid Malformation (CCAM). Os avanços no diagnóstico pré-natal de patologias genéticas e congénitas devido a técnicas progressivamente mais sensíveis, aumenta as oportunidades de aplicação de terapias génicas prénatais. Existem várias patologias pulmonares genéticas e adquiridas que se manifestam no período peri e pós-natal. Estas incluem doenças monogenéticas como a Fibrose Cística ou a Deficiência em Proteína Surfactante B, que requerem expressão a longo-termo do gene em causa. No entanto, existem também patologias relacionadas com crescimento pulmonar, como a Hérnia Diafragmática Congénita, ou maturação pulmonar, como o Síndrome Prematuro de Distress Respiratório, que podem beneficiar de estratégias de indução de expressão genica de forma transiente. Considerado um aliciante órgão-alvo para a terapia génica fetal, o pulmão fetal, coloca alguns obstáculos que só poderão ser ultrapassados com o desenvolvimento de várias metodologias: tipos de vectores, optimização de local, via e período de transferência génica. O fundamento desta dissertação foi modular crescimento/maturação pulmonar através de transferência génica in utero, pretendendo esclarecer os mecanismos moleculares reguladores no desenvolvimento pulmonar normal e anormal. O primeiro objectivo desta dissertação foi desenvolver uma nova abordagem de transferência génica para o pulmão nas fases inicias do seu desenvolvimento. Desenvolveu-se um novo método de injecção directa de vectores víricos no pulmão fetal de rato, durante a fase pseudoglandular, utilizando microinjecções guiadas por ultrasonografia. A fase pseudoglandular, caracterizada por intensa ramificação e crescimento global das vias aéreas e vasculatura do pulmão fetal, corresponde a um estadio de imaturidade imunológica. Sendo assim, a transferência génica durante este período terá, um maior efeito em elementos fundamentais do crescimento pulmonar com menor hipótese de desencadear respostas imunes. Dois tipos distintos de vectores víricos foram utilizados: um vector adenovírico e um vector lentivírico (Equine Infectious Anemia Virus), ambos expressam Enhanced Green Fluorescent Protein como gene marcador. Este estudo confirmou que os vectores adenovíricos são mais adequados quando se pretende obter expressão rápida, elevada e transiente do transgene; enquanto que os vectores lentivíricos induzem uma expressão sustentada no tempo. Uma das preocupações nos protocolos de transferência génica é atingir especificamente um determinado compartimento celular de um determinado órgão ou sistema. É de salientar que, ambos os vectores, transfectaram células do compartimento interstitial em oposição ao epitelial, descrito em estudos anteriores em que as vias de administração foram a intrapulmonar, a intra-amniótica e a intra-traqueal. A transdução de populações celulares distintas em estreita relação com o tipo de via de administração, aumenta as possibilidades de manipulação genética do pulmão em desenvolvimento. A etapa seguinte consiste em utilizar este modelo para efectuar um estudo in vivo da morfogénese pulmonar, manipulando um dos factores fundamentais no processo de ramificação, o fibroblast growth factor 10 (FGF10). A sobreexpressão mesenquimatosa de FGF10, no pulmão fetal de rato, resultou na indução de malformações císticas, cujo fenótipo era dependente do local e período em que se induzia essa mesma sobreexpressão. O fenótipo de todos os tipos de malformações induzidas, parece recapitular todo o espectro da Malformação Cística Adenomatoide Congénita do humano. Tese de doutoramento em Ciências da Saúde (ramo de conhecimento em Ciências Biológicas e Biomédicas) Fundação para a Ciência e Tecnologia e FSE através do programa POCTI 2010, sobre a forma de bolsa (referência SFRH/BD/15260/2004) e sob a forma de projecto (POCI/SAL-OBS/56248/2004).
Advances in prenatal diagnosis of genetic and congenital disorders with progressively more sensitive techniques may increase opportunities for consideration of prenatal gene therapy. There are a number of genetic and acquired disorders with peri or postnatal pulmonary manifestations. These include monogenetic diseases like cystic fibrosis or surfactant protein B deficiency that would presumably require long-term expression of the deficient or defective gene. However, there are also abnormalities of lung growth, such as congenital diaphragmatic hernia, or lung maturation, such as respiratory distress syndrome of prematurity, that could potentially benefit from strategies that achieve transient gene expression in specific pulmonary distributions. Considered an attractive target organ for fetal gene transfer, the developing lung, poses also some obstacles that would only be overcomed with the development of a variety of gene transfer methodologies: different types of vector, optimal site, route and timing of gene delivery. The fundament of this dissertation was to modulate lung growth/maturation by in utero gene transfer, aiming to unveil underlying mechanisms of normal and abnormal lung development. The first objective of this dissertation was to develop a new approach of gene transfer targeting the fetal lung in early stages of lung development. We developed a new method for direct injection of viral vectors into the rat fetal lung as early as the pseudoglandular phase of lung development using ultrasound guided microinjections. The pseudoglandular stage, characterized by intense branching morphogenesis, is the period of greatest overall growth of the airways and vasculature of the fetal lung and corresponds to a stage of immunologic immaturity. Therefore, gene transfer during this period has the potential to have major effects on key elements of lung growth with minimal potential for detrimental immune responses. We aimed to compare two distinct types of vectors: an adenoviral vector and a lentiviral vector (equine infectious anemia virus-based), both expressing the enhanced green fluorescent protein reporter gene. This study confirmed that adenoviral vectors are more suitable when rapid, high-level and transient expression of the transgene is required; whereas lentiviral vectors are more appropriate to induce sustained and long-term expression. One of the concerns in gene transfer protocols is to target a specific cellular compartment of a determined organ/system. Interestingly, interstitial compartment rather than epithelial cells were transduced in opposition to previous studies describing intrapulmonary, intraamniotic and intratracheal administrations of viral vectors. The observation of transduction of distinct cell populations within the lung with different routes of transduction raises the possibility of manipulating gene expression in specific and separate cell populations within the developing lung. We then decided to use this model system to perform an in vivo study of dynamic lung morphogenesis, involving a major player in branching morphogenesis, fibroblast growth factor 10 (FGF10). We observed that FGF10 mesenchymal overexpression, on the fetal rat lung, resulted in the induction of consistent patterns of malformation, the appearance of which were developmental stage and location dependent. These malformations, in total, appear to closely recapitulate the morphology and histology of the entire spectrum of human Congenital Cystic Adenomatoid Malformation (CCAM). Os avanços no diagnóstico pré-natal de patologias genéticas e congénitas devido a técnicas progressivamente mais sensíveis, aumenta as oportunidades de aplicação de terapias génicas prénatais. Existem várias patologias pulmonares genéticas e adquiridas que se manifestam no período peri e pós-natal. Estas incluem doenças monogenéticas como a Fibrose Cística ou a Deficiência em Proteína Surfactante B, que requerem expressão a longo-termo do gene em causa. No entanto, existem também patologias relacionadas com crescimento pulmonar, como a Hérnia Diafragmática Congénita, ou maturação pulmonar, como o Síndrome Prematuro de Distress Respiratório, que podem beneficiar de estratégias de indução de expressão genica de forma transiente. Considerado um aliciante órgão-alvo para a terapia génica fetal, o pulmão fetal, coloca alguns obstáculos que só poderão ser ultrapassados com o desenvolvimento de várias metodologias: tipos de vectores, optimização de local, via e período de transferência génica. O fundamento desta dissertação foi modular crescimento/maturação pulmonar através de transferência génica in utero, pretendendo esclarecer os mecanismos moleculares reguladores no desenvolvimento pulmonar normal e anormal. O primeiro objectivo desta dissertação foi desenvolver uma nova abordagem de transferência génica para o pulmão nas fases inicias do seu desenvolvimento. Desenvolveu-se um novo método de injecção directa de vectores víricos no pulmão fetal de rato, durante a fase pseudoglandular, utilizando microinjecções guiadas por ultrasonografia. A fase pseudoglandular, caracterizada por intensa ramificação e crescimento global das vias aéreas e vasculatura do pulmão fetal, corresponde a um estadio de imaturidade imunológica. Sendo assim, a transferência génica durante este período terá, um maior efeito em elementos fundamentais do crescimento pulmonar com menor hipótese de desencadear respostas imunes. Dois tipos distintos de vectores víricos foram utilizados: um vector adenovírico e um vector lentivírico (Equine Infectious Anemia Virus), ambos expressam Enhanced Green Fluorescent Protein como gene marcador. Este estudo confirmou que os vectores adenovíricos são mais adequados quando se pretende obter expressão rápida, elevada e transiente do transgene; enquanto que os vectores lentivíricos induzem uma expressão sustentada no tempo. Uma das preocupações nos protocolos de transferência génica é atingir especificamente um determinado compartimento celular de um determinado órgão ou sistema. É de salientar que, ambos os vectores, transfectaram células do compartimento interstitial em oposição ao epitelial, descrito em estudos anteriores em que as vias de administração foram a intrapulmonar, a intra-amniótica e a intra-traqueal. A transdução de populações celulares distintas em estreita relação com o tipo de via de administração, aumenta as possibilidades de manipulação genética do pulmão em desenvolvimento. A etapa seguinte consiste em utilizar este modelo para efectuar um estudo in vivo da morfogénese pulmonar, manipulando um dos factores fundamentais no processo de ramificação, o fibroblast growth factor 10 (FGF10). A sobreexpressão mesenquimatosa de FGF10, no pulmão fetal de rato, resultou na indução de malformações císticas, cujo fenótipo era dependente do local e período em que se induzia essa mesma sobreexpressão. O fenótipo de todos os tipos de malformações induzidas, parece recapitular todo o espectro da Malformação Cística Adenomatoide Congénita do humano. Tese de doutoramento em Ciências da Saúde (ramo de conhecimento em Ciências Biológicas e Biomédicas) Fundação para a Ciência e Tecnologia e FSE através do programa POCTI 2010, sobre a forma de bolsa (referência SFRH/BD/15260/2004) e sob a forma de projecto (POCI/SAL-OBS/56248/2004).
Document Type
Doctoral Thesis
Language English
Advisor(s) Pinto, Jorge Manuel Nunes Correia; Flake, Alan Wayne
Language English
Advisor(s) Pinto, Jorge Manuel Nunes Correia; Flake, Alan Wayne
