Sobreexpressão e purificação da carbapenemase SFC-1 produzida por um isolado deserratia fonticola

• Author(s): Fonseca, Maria Fátima da
• Date: 2005
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/709
• Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
• Subject(s): Microbiologia molecular
• Document Type: Master thesis
• Language: Portuguese

Description

A espécie Serratia fonticola inclui organismos que ocorrem naturalmente em águas. A maioria das estirpes expressa uma beta-lactamase cromossomal de espectro alargado de classe A (SFO-1), e uma beta-lactamase do tipo AmpC, específica da espécie. A estirpe S. fonticola UTAD54, isolada de águas de consumo não tratadas no Nordeste de Portugal, mostrou ser resistente a vários antibióticos beta-lactâmicos incluindo os carbapenemos. O genoma da estirpe UTAD54 codifica para uma metalo-enzima, Sfh-I, e uma nova ßlactamase de classe A, SFC-1. Estas enzimas estão ausentes noutras estirpes de S. fonticola. Para a compreensão deste complexo padrão de resistência iniciou-se a caracterização da beta-lactamase SFC-1. Depois da amplificação por PCR utilizando primers específicos, o gene blaSFC-1 foi clonado no vector de expressão pTrcHis e introduzido em células E. coli TOP10F’. A construção foi confirmada por análise de restrição e sequenciação de DNA. Foram preparados extractos brutos das células do clone de E. coli produtor da enzima recombinante. A actividade ß-lactâmica foi detectada com nitrocefin em géis de SDS-PAGE. Apesar da produção de proteína recombinante ter sido confirmada, o sistema formado por pTrcHis e E. coli TOP10F’ demonstrou não ser adequado à sobreexpressão da enzima SFC-1. Foram desenhados novos primers de PCR específicos contendo os locais de restrição apropriados à clonagem de blaSFC-1 no vector de expressão pET-26(+). A construção foi confirmada por análise de restrição e sequenciação de DNA e introduzida na estirpe hospedeira de expressão E. coli BL21(DE3). A utilização de extractos brutos em ensaios de actividade com aztreonamo e géis de poliacrilamida com SDS confirmou a expressão da enzima SFC-1 na sua forma activa. Testes de susceptibilidade mostraram um elevado nível de resistência ao imipenemo e meropenemo com MICs de 32 μg/ml. Foram estabelecidas as condições de cultura mais apropriadas à obtenção de uma elevada quantidade de enzima SFC-1 no seu estado nativo. A purificação da enzima foi efectuada por cromatografia de troca catiónica e de exclusão molecular. A pureza da preparação da SFC-1 foi visualizada por SDS-PAGE. A enzima SFC-1 pura tem aproximadamente 30,7 kDa. ABSTRACT: The species Serratia fonticola, includes organisms that occur in environmental waters. Most of strains express both a chromosomally encoded extendedspectrum class A beta-lactamase (SFO-1) and a species-specific AmpC betalactamase. S. fonticola UTAD54, isolated from untreated drinking waters in the Northeast of Portugal, showed to be resistant to carbapenems. The genome of strain UTAD54 encodes a metallo-enzyme, Sfh-I, and a novel class A ßlactamase, SFC-1. Those enzymes are absent from other S. fonticola strains. For a better understanding of this complex pattern of resistance we started the characterization of the enzyme SFC-1. After PCR amplification using specific primers, the blaSFC-1 gene was cloned in the expression vector pTrcHis and introduced in E. coli TOP10F’ cells. The construction was confirmed by restriction analysis and DNA sequencing. Crude cell extracts of the E. coli clone expressing the recombinant enzyme were prepared. Beta-lactamase activity was detected with nitrocefin on SDS-PAGE gels. Although producing the recombinant protein, the system constituted by pTrcHis and E. coli TOP10F didn´t prove to be useful to overexpress the SFC-1 enzyme. PCR specific primers were designed to contain the appropriate restriction sites for cloning the blaSFC-1 gene in the expression vector pET-26(+). The construction was transformed into the expression host E. coli BL21(DE3). Restriction analysis and DNA sequencing confirmed the construction. The use of crude cell extracts in activity assays with aztreonam and SDS -PAGE gels confirmed the expression of the SFC-1 enzyme. Susceptibility tests showed a high-level resistance to imipenem and meropenem with MICs of 32 μg/ml for both drugs. The appropriate culture conditions to obtain a large quantity of the SFC-1 enzyme in the native state were established. Protein purification was made by ion-exchange chromatography and gel filtration. The purity of the SFC-1 preparation was visualized by SDS -PAGE. The purified SFC-1 has approximately 30,7 kDa.