Author(s): Silva, Inês Esteves Domingues Pires da
Date: 2016
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10362/18520
Origin: Repositório Institucional da UNL
Subject(s): Melanoma; Imunoterapia; Melanomacélulas NK; Tim-3; Exaustão de células; Melanoma; Immunotherapy; Natural killer cells; Tim-3; Immune cell exhaustion,; Ciências Médicas
RESUMO: O melanoma é o quinto tumor maligno mais comum nos homens (sétimo nas mulheres) e a sua incidência está a aumentar mais rapidamente do que a de qualquer outro cancro. É o tipo de cancro cutâneo mais agressivo; corresponde a apenas 2% de todos os cancros de pele, mas é responsável por mais de 70% das mortes causadas pelo cancro cutâneo. O melanoma responde mal à terapia sistémica e tem mau prognóstico nos doentes com metástases à distância, com uma taxa de sobrevivência global aos 2 anos que varia entre os 18 e os 40%. No contexto do cancro identificamos duas respostas imunológicas opostas: uma resposta aguda anti-tumoral com predomínio de células Th1 podendo, consequentemente, levar a uma reacção auto-imune; e uma resposta inflamatória pró-tumoral, caracterizada por uma tolerância imunológica através de mecanismos imunossupressores. Durante a progressão do tumor verifica-se um desequilíbrio com um predomínio da resposta inflamatória pró-tumoral e disfunção das células anti-tumorais Th1. O conceito de "exaustão dos linfócitos T” tem sido desenvolvido nos últimos anos e pode explicar a disfunção das células Th1. Este conceito de "exaustão dos linfócitos T", consequência do microambiente tumoral ou de outros factores, foi descrita pela primeira vez em doenças infecciosas crónicas e mais recentemente em diferentes tipos de cancro, em particular no melanoma. Este fenótipo é caracterizado pela perda progressiva da capacidade de proliferação, do potencial citotóxico e da capacidade de produzir interleucina 2 (IL-2). A “exaustão dos linfócitos T” no contexto do cancro metastático tem sido reforçado pelo recente sucesso de imunoterapias dirigidas aos marcadores de exaustão expressados pelos linfócitos T, incluindo o CTLA-4 e o PD-1, em doentes com melanoma avançado. No entanto, o fenótipo e a função das NK em diferentes fases da progressão do tumor e a sua relação com fatores de prognóstico ainda é desconhecida. As células NK pertencem ao sistema imune inato e têm um papel importante na resposta antitumoral. A função destas células depende do equilíbrio entre os receptores de activação e de inibição, e da expressão dos respectivos ligandos no microambiente tumoral. O Tim-3, outro marcador de exaustão dos linfócitos T juntamente com o CTLA-4 e o PD-1, comporta-se como um receptor inibitório nos linfócitos T e tem um papel fundamental para a manutenção da tolerância imunológica. O Tim-3 também é expresso nas células NK, no entanto o seu papel na modulação da função destas células permanece pouco claro, em particular no contexto do cancro. Os objetivos deste estudo foram: caracterizar o fenótipo e a função das células NK em doentes com melanoma; identificar moléculas, que possam estar envolvidas no mecanismo da exaustão das células NK, como potenciais marcadores de prognóstico no melanoma; definir o papel do Tim-3 expresso nas células NK de doentes com melanoma avançado; e estudar o efeito do bloqueio de checkpoints imunológicos no fenótipo e função das células NK no contexto dos doentes com melanoma avançado. Os nossos dados mostraram que as células NK de doentes com melanoma avançado exibem um fenótipo de exaustão imunológica que é caracterizado por uma expressão aumentada dos receptores inibitórios KIR3DL1 e KIR2DL3, por uma expressão diminuida dos receptores de activação NKG2D, NKp46 e DNAM-1, por uma resposta deficiente à estimulação com IL-2, por uma regulação negativa dos fatores de transcrição T-bet e Eomes, e por um défice de função (citotoxicidade, produção de IFN-γ e proliferação). As células NK adquirem gradualmente este fenótipo de exaustão imunológica à medida que a doença avança dos estadios iniciais (estadios I e II) para estadios mais avançados (estadios III e IV). Curiosamente, este fenótipo de exaustão das células NK está associado as parâmetros clinico-patológicos com valor prognóstico conhecido, como a espessura e a presença/ausência de metástases (regionais e à distância). Além disso, níveis elevados de MICA solúvel (ligando do receptor NKG2D) no plasma podem estar envolvidos no mecanismo de exaustão das células NK e identificam doentes com sobrevivência global e tempo de livre de doença mais curtos. Neste trabalho também identificamos o Tim-3 como um receptor inibitório e com uma expressão aumentada nas células NK de doentes com melanoma avançado, e que desempenha um papel chave no fenótipo de exaustão destas células. Mais importante, mostramos ainda que o bloqueio do receptor Tim-3 consegue reveter, em parte, este fenótipo de exaustão, com um aumento da citotoxicidade em 20%, da produção de IFN-γ em 15% e da proliferação em 60%. Finalmente, caracterizamos o efeito do ipilimumab (anti-CTLA-4) no fenótipo de exaustão das células NK de doentes com melanoma avançado. Notavelmente, as células NK de doentesrespondedores ao tratamento com ipilimumab apresentaram níveis mais elevados de IL-2R e, por conseguinte, maior citotoxicidade em resposta à estimulação com IL-2. Estes dados abrem caminho para novas estratégias terapêuticas com base nas células NK, incluindo o bloqueio do receptor Tim-3 no contexto de melanoma. Além disso, uma melhor compreensão do mecanismo subjacente à exaustão das células NK irá definir novos marcadores de prognóstico e estratégias terapêuticas.
ABSTRACT: Melanoma is the fifth most common cancer in men (seventh in women) and its incidence is increasing more rapidly than that of any other malignancy. It is the most aggressive type of skin cancer; although it accounts for 2% of all skin cancers it leads to more than 70% of their deaths. In fact, melanoma responds poorly to systemic therapy and the overall prognosis of patients with distant metastasized melanoma remains poor; the 2-year overall survival rate ranges from 18 to 40%. In the context of cancer two opposite immune responses exist: an acute T helper (Th) 1 antitumoral response that requires a substantial autoimmune attack; and a pro-tumorigenic inflammatory response, characterized by an immune tolerance via active immunosuppressive mechanisms. During tumor progression there is an imbalance with a stronger pro-tumorigenic inflammatory response, while the anti-tumoral Th1 cells display a dysfunctional phenotype. The new concept of “T cell exhaustion”, that has been developped in the past few years, can explain T cell dysfunction. This “T cell exhaustion”, either caused by environmental influence or other factors, was first described in chronic infectious diseases and more recently in different types of cancer, particularly in melanoma. This phenotype is characterized by early loss of proliferative capacity, cytotoxic potential, and the ability to produce interleukin (IL)-2. The concept of T cell exhaustion in the context of metastatic cancer has been reinforced by the recent success of immunotherapies targeting the exhaustion markers cytotoxic Tlymphocyte- associated protein 4 (CTLA-4) and programmed (cell) death 1 (PD-1) in advanced melanoma. However, the phenotype and function of natural killer (NK) cells in different phases of tumor progression and their relationship with prognostic factors is still unknown. NK cells are innate immune cells, prone to target tumor cells, whose function depends on the balance between activating and inhibitory receptors, and on the expression of the respective ligands in their microenvironment. T cell immunoglobulin domain and mucin domain 3 (Tim- 3), another T cell exhaustion marker along with CTLA-4 and PD-1, behaves as an inhibitory receptor in T cells and is key in the maintenance of immune tolerance. Tim-3 is also expressed in NK cells; however its role in modulating the function of these innate effector cells remains unclear, particularly in human disease. The aims of this study were: to characterize the phenotype and function of NK cells from melanoma patients; to identify potential players in the mechanism of NK cell exhaustion as prognostic markers; to define the role of Tim-3 expression in NK cells from advanced melanoma patients; and to study the effect of checkpoint blockade in NK cell phenotype and function in the context of advanced melanoma patients. Our data showed that NK cells from patients with advanced melanoma display an exhausted phenotype that is characterized by upregulation of inhibitory receptors (Killer cell Immunoglobulin-like receptor 3DL1 and 2DL3 - KIR3DL1 and KIR2DL3, respectively), downregulation of activating receptors (natural-killer group 2D (NKG2D), natural killer p46 (NKp46) and DNAX accessory molecule-1 (DNAM-1)), unresponsiveness to IL-2 stimulation, downregulation of the transcription factors T-box (T-bet) and eomesodermin (Eomes), and defective function. The latter includes the main NK cell functions, cytotoxicity, interferon gamma (IFN-γ) production and proliferation. NK cells acquire this exhausted phenotype gradually as disease advances from early (stages I and II) to later stages (stages III and IV). Moreover, the exhaustion of NK cells is associated with clinicopathological parameters that have known prognostic value, such as thickness and presence/absence of metastases (regional and distant). In addition, high serum levels of soluble MHC class I chain-related genes A (sMICA), an NKG2D ligand (NKG2DL) that may be involved in the mechanism of NK cell exhaustion, identify patients with shorter diseasefree and overall survival. We also identified Tim-3 as an inhibitory receptor over-expressed in NK cells from advanced melanoma patients that plays a key role in the exhausted phenotype of these cells. Significantly, we demonstrated that Tim-3 blockade partially reversed this exhausted phenotype. Therefore, in average, it was possible to enhance cytotoxicity by 20%, IFNγ production by 15% and proliferation by 60%. Finally, we characterized the effect of ipilimumab (anti-CTLA-4) on exhausted NK cells from advanced melanoma patients. Remarkably, NK cells from responders to ipilimumab treatment have higher levels of IL-2 receptor (IL-2R), and consequently, are more responsive to IL-2 stimulation and more cytotoxic.These data open exciting avenues for new NK cell-based therapies, including targeting Tim-3 in the context of melanoma. Moreover, a better understanding of the mechanism behind NK cell exhaustion will help defining new prognostic markers and therapeutic strategies.
