Author(s): Sommières, Mahaut Diane Marie Stéphanie de Labrouë de Vareilles
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.1/6682
Origin: Sapientia - Universidade do Algarve
Subject(s): Aquacultura; Nutrição; Larvas de peixe; Músculo esquelético
Aquaculture is one of the most promising sources for food protein for humans. However, it still faces many challenges concerning its ecologic-, economic- and socially sustainable development. One main issue is the dependency on limited marine resources for the production of aquafeeds. Concerning protein ingredients in aquafeeds, finding alternative sources to fishmeal is necessary. Thus it is crucial that research be further invested towards understanding of dietary nitrogen utilisation by fish, making use of novel tools in molecular biology (“omics” approaches). This thesis aimed to further explore how the growth of early-life stages of fish can be affected by the availability of dietary nitrogen through a comparative proteomics approach (2-DE and MALDI-ToF-ToF mass spectrometry), focusing particularly on skeletal muscle. Two important Mediterranean mariculture species (Diplodus sargus and Sparus aurata), and the model organism zebrafish (Danio rerio), were used for evaluating the effects of dietary inclusion level and peptide size distribution profile of fish protein hydrolysates (FPH) in larval stages (Chapters 2 - 4), and juvenile fish (Chapter 5), respectively. Juvenile zebrafish were also used for evaluating the effect of dietary content of an indispensable amino acid (AA), lysine, on growth and muscle proteome (Chapter 6). It is seen that a moderate dietary inclusion level of FPH improve larval growth but has no effect on juvenile fish compared to an intact-protein based diet. Also, the importance of peptide distribution profile of dietary FPH is evinced. A dietary excess of short peptides and free AA is confirmed as detrimental to protein anabolic efficiency in both larvae and juveniles. Dietary lysine is conformed as essential for muscle growth of fish, possibly influencing muscle growth pattern in zebrafish. This thesis contributes to improving our understanding of the possible metabolic and regulatory pathways in the early-life stages of fish affected by the dietary nitrogen source, including a critical evaluation of a comparative proteomics approach in this endeavour.
A aquacultura constitui hoje em dia uma das fontes mais promissoras de proteína alimentar para o Homem. No entanto, este sector depara-se ainda com numerosos desafios relativamente ao seu desenvolvimento ecológica-, económica- e socialmente sustentável. Uma das principais questões é a dependência de recursos marinhos já limitados, para a produção de rações alimentares para os peixes cultivados. No que diz respeito à fonte proteica dos alimentos, torna-se cada vez mais necessário encontrar ingredientes alternativos à farinha de peixe habitualmente utilizada. Nesse sentido, é fundamental que a investigação científica aposte na compreensão da utilização alimentar do azoto pelas espécies cultivadas, recorrendo às novas ferramentas da biologia molecular (tecnologias "omics"), além do uso de técnicas mais clássicas. As ferramentas "omics" oferecem metodologias compreensivas para estudar sistemas bioquímicos, expandindo o nível de investigação do estudo de moléculas únicas ao estudo simultâneo de amplas gamas de moléculas presentes numa célula ou tecido, em termos de presença e abundância relativas, sem ser necessário possuir conhecimento a priori. Tendo isto em conta, esta tese pretendeu explorar como o crescimento de fases iniciais da vida do peixe pode ser afectado pela disponibilidade de azoto alimentar, utilizando proteómica comparativa, com foco particular no músculo-esquelético, um tecido per se excelente indicador de crescimento e acreção proteica. Mais concretamente, procurou-se aprofundar o conhecimento das possíveis vias metabólicas e regulatórias afectadas pela inclusão de hidrolisados protéicos de pescado (HPP) na ração de larvas e juvenis, e pelo conteúdo em lisina nas dietas para juvenis. Os HPP foram escolhidos porque constituem uma fonte alternativa à farinha de peixe pura, já que têm potencial como forma económica e prática de converter subprodutos de pescado em ingredientes proteicos aceitáveis para a indústria de rações de aquacultura. O efeito no crescimento da inclusão da lisina no alimento foi estudado visto que a lisina é um amino ácido essencial e frequentemente limitante quando são incorporadas fontes proteicas alternativas nos alimentos, como por exemplo, de origem vegetal. Assim sendo, nos Capítulos 2, 3 e 4 da presente tese, estudou-se o efeito dos HPP alimentares no crescimento, expressão de proteínas e utilização de azoto em larvas de peixe. No capítulo 1, utilizou-se larvas de sargo (Diplodus sargus), uma espécie relativamente nova e promissora na aquacultura de países Mediterrânicos, para avaliar três alimentos: uma dieta de referência para larvas, contendo 10 % de um HPP amplamente utilizado e disponível comercialmente (CPSP-90, Sopropêche, France) e duas dietas experimentais, contendo diferentes fracções de HPP, diferindo na distribuição do tamanho dos péptidos, a um nível de inclusão de 20 %. Para além de uma avaliação zootécnica (crescimento, sobrevivência), recorreu-se a uma análise clássica de electroforese bidimensional (2-DE) para separação de proteinas do corpo larvar inteiro, junto com espectrometria de massa por MALDI-ToF-ToF para identificação de proteínas cuja expressão fora alterada pelas dietas experimentais. Nos capítulos 3 e 4, utilizando desta vez larvas de uma das espécies mais importantes na aquacultura Mediterranica, a dourada (Sparus aurata), a abordagem proteómica foi feita recorrendo à técnica altamente sensível 2-D DIGE e focou-se no proteoma da carcaça, em vez de corpo inteiro. Adicionalmente, apenas um tipo (fonte, método de hidrólise) de hidrolisado proteico foi comparado, com diferentes níveis de inclusão no alimento (Capítulo 3) e com diferentes fracções de tamanhos de péptidos (Capítulo 4). De modo a trazer informação complementar ao “screening” obtido pela análise proteómica comparativa e compreender melhor como o crescimento e sobrevivência larvar são afectados pelo azoto alimentar, recorreu-se à análise de excreção larvar de amónia e a um ensaio de marcação radioactiva do alimento vivo, Artemia sp., com hidrolisados proteicos radioactivos para estudar a capacidade digestiva das larvas e o seu metabolismo de azoto. No capítulo 5, a análise por proteómica comparativa foi mais apurada ainda, através da utilização do peixe-zebra (Danio rerio) como organismo modelo (para o qual o genoma se encontra inteiramente sequenciado, o que gera uma muito melhor fiabilidade na identificação proteica) e através da redução da complexidade da amostra proteica estudada (isto é, focando o proteoma sarcoplasmático do músculo esquelético epaxial do tronco). Pretendeu-se desta forma estudar os efeitos do perfil de distribuição dos tamanhos peptídicos dos HPP usados nas dietas no crescimento e proteoma do músculo de peixes juvenís. No Capítulo 6, procurou-se aprofundar o conhecimento sobre os efeitos do conteúdo alimentar em lisina no crescimento, através da análise do proteoma do músculo-esquelético epaxial do tronco de peixe-zebras juvenis. Foi observado que uma inclusão moderada (10-20 % da matéria seca) de HPP nas dietas larvares, tanto de sargo como de dourada, pode beneficiar o crescimento larvar, desde que o conteúdo total de proteína bruta, bem como o conteúdo de di- e tripéptidos e amino ácidos livres sejam tidos em consideração e mantidos abaixo de determinados limites máximos. Por outro lado, no caso dos juvenis de peixe-zebra (agástricos), o aumento da solubilidade e digestibilidade da proteína alimentar através da inclusão de 30 % (matéria seca) de HPP, com uma distribuição equilibrada do perfil de tamanho dos péptidos, não resulta num efeito benéfico em termos de crescimento, quando comparada com uma dieta baseada em proteína intacta (i.e. não hidrolisada). Independentemente do estado de desenvolvimento, condições ambientais e espécie (marinha, de águas temperadas, como as larvas de sargo e dourada, ou de água doce e tropical como os juvenis de peixe-zebra), fornecer um excesso de péptidos curtos e amino ácidos livres na dieta resulta em efeitos negativos no crescimento e/ou sobrevivência e utilização geral do azoto alimentar, que se reflectem principalmente em alterações do “turnover” proteico no músculo, com aumento do catabolismo. Este efeito foi também induzido por uma deficiência alimentar em lisina em juvenis de peixe-zebra, confirmando a observação geral de que os desequilíbrios em amino ácidos alimentares resultam na redução da eficiência anabólica em peixes. Foi também visto que é necessário ter em atenção a estrutura molecular dos péptidos constituintes dos HPP e a sua concentração global nas dietas. Este facto é particularmente evidente no Capítulo 4, onde o aumento do nível de inclusão das fracções de maior tamanho da proteína hidrolisada, sob a suposição de que a inclusão resultaria num aumento da biodisponibilidade do azoto nas dietas larvares sem elevar de forma abrupta o afluxo de amino ácidos no sistema, não resultou em melhorias no crescimento, e pelo contrário teve o efeito oposto. A utilização da tecnologia da proteómica comparativa (2-DE/2D-DIGE e MALDI-ToF-ToF MS) foi uma abordagem útil, já que as proteínas cuja expressão foi afectada pelos tratamentos experimentais complementaram os resultados do crescimento e utilização do azoto, e ajudaram à sua interpretação. Adicionalmente, o uso desta abordagem inovadora permitiu a visualização de padrões de resposta às dietas experimentais que não foram detectadas pela análise do crescimento e da sobrevivência apenas, e que demostra a utilidade desta técnica para estudos futuros. É também relevante referir que o uso desta abordagem permitiu a identificação de candidatos específicos para estudos futuros mais dirigidos, o que sublinha a sua utilidade. No entanto, a principal mensagem a reter da presente tese, que é inerente ao dinamismo e sensibilidade do proteoma a sinais ambientais e mudanças subtis do estado fisiológico, é que estudos adicionais irão beneficiar grandemente da redução da complexidade das amostras (heterogeneidade dos tecidos) e da obtenção e utilização de tanta informação contextual quanto possível ( incluindo observações obtidas através de métodos clássicos e/ou de outras abordagens “omics”), de forma a melhorar a interpretação dos resultados da proteómica.
Universidade do Algarve, Faculdade de Ciências e Tecnologia
