Microbiome diversity and composition in the phylogenetically related marine sponges S. spinosulus and I. variabilis

• Author(s): Hardoim, Cristiane Cassiolato Pires
• Date: 2013
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.1/6738
• Origin: Sapientia - Universidade do Algarve
• Subject(s): Microbiologia; Comunidades; Sistemas simbióticos; Biogeografia
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Costa, Rodrigo; Cox, Cymon J.; Canario, Adelino V. M.
• Contributor(s): Sapientia

Description

In this Thesis the theory of a uniform prokaryotic community associated with marine sponges was challenged. To this end, an in-depth inspection of the abundance, diversity, and composition of prokaryotic communities in the phylogenetically related marine sponges S. spinosulus and I. variabilis was undertaken. The within-habitat, between-habitat and temporal dynamics of these communities were disclosed. Further, an innovative approach to measure bacterial cultivation bias in the characterization of these communities was employed. Using state-of-the-art imaging technologies, both sponge species were classified as high microbe abundance sponges and bacterial cells were shown to be mainly associated with sponge cells and to neglect the sponge skeleton. PCR-DGGE fingerprinting was initially used and revealed that, within the same habitat, distinct bacterial communities were associated with S. spinosulus and I. variabilis. This was latter confirmed by 454 pyrosequencing of the same communities. Further, when two different cultivation-independent methods were applied to profile the bacterial communities associated with these hosts, a similar structure was obtained for S. spinosulus specimens, whereas the same was not true for I. variabilis. Using a common cultivation-dependent method, an alike bacterial community was detected in both sponge species, as opposed to the species-specific profiles obtained via cultivation-independent methods. Unexpectedly, around half of the OTUs recovered with the cultivation-dependent method was exclusive to this procedure. When between-habitat comparisons were made, replicates from the same sponge species were more similar to one another than replicates of different species independently of the sampling sites. Furthermore, the bacterial community associated with S. spinosulus displayed a state of dynamic stability over three consecutive years, whereby about half of the observed S. spinosulus could be detected in all sampling years. Remarkably, the archaeal community associated with S. spinosulus was dominated by one single OTU affiliated with Nitrosopumilus sp., a known ammonia-oxidizer. Overall, the prokaryotic community associated with S. spinosulus and I. variabilis was species-specific, and these communities were also maintained across biogeographical and temporal gradients, however the environmental also played a role.

Esponjas marinhas são conhecidas por abrigar uma comunidade microbiana diversa e complexa. Inúmeros compostos bioativos têm sido isolados destes animais e acredita-se que os simbiontes sejam os produtores de pelo mesmo parte destes metabolitos, revelando assim um grande potencial biotecnológico. Uma das teorias desenvolvidas na área de microbiologia de esponjas marinhas estabelece que a composição da comunidade procariótica associada a estes animais é uniforme. Com o objectivo de testar esta teoria com acurácia, a abundância, diversidade e composição da comunidade procariótica em duas espécies de esponja pertencentes à família Irciniidae (classe Demospongiae, ordem Dictyoceratida), nomeadamente Sarcotragus spinosulus e Ircinia variabilis, foram investigadas em profundidade na presente Tese. Estas comunidades simbióticas foram caracterizadas em espécimes de ambas as espécies recolhidas em um mesmo habitat (costa do Algarve), em habitats diferentes (na costa do Algarve assim como nos arquipélagos da Madeira e dos Açores) e ao longo de três anos consecutivos (costa do Algarve). No último caso, foram coletadas apenas espécimes de S. spinosulus. Para além das espécimes de esponja, foram também recolhidas, em réplicas, amostras da água do mar circundante às esponjas e de sedimentos. Uma abordagem inovadora foi implementada para averiguar a eficiência de um método tradicional de cultivo na caracterização das comunidades procarióticas. Inúmeras técnicas foram empregadas à avaliação destas comunidades, especialmente de biologia molecular, tais como PCR-DGGE (reação em cadeia da polimerase – eletroforese em gel de gradiente denaturante) e pirosequenciação em massa com o uso da tecnologia 454. A abundância procariótica analisada com microscopia de epifluorescência em espécimes coletadas em um mesmo habitat revelou que: i) S. spinosulus abriga uma abundância procariótica significativamente maior quando comparada com I. variabilis e ii) a abundância detectada nas duas espécies de esponjas é significativamente superior, em 4 a 5 ordens de magnitude, à abundância procariótica encontrada na água do mar. Com base nesses resultados, S. spinosulus e I. variabilis foram classificadas como esponjas de alta abundância microbiana (“high microbial abundance sponges”). A comunidade bacteriana foi inicialmente investigada via PCR-DGGE, revelando em S. spinosulus uma menor variabilidade entre as réplicas e foi diferente da observada em I. variabilis, que mostrou maior variabilidade entre os replicados. Além disso, as comunidades bacterianas associadas às duas espécies de esponja foram distintas da observada na água do mar coletada nas proximidades das esponjas. Consequentemente, a comunidade bacteriana associada com S. spinosulus e I. variabilis é específica de cada espécie de esponja e distinta do ambiente. Os efeitos dos métodos independentes de cultivo e dependente de cultivo para a obtenção do DNA (ácido desoxirribonucleico) microbiano associado às esponjas foram determinados via PCR-DGGE e pirosequenciação em massa. A estrutura das comunidades bacterianas associadas à S. spinosulus acedidas pelos métodos independentes de cultivo foi semelhante, enquanto o oposto foi observado para I. variabilis. Portanto, os resultados obtidos com a pirosequenciação em massa confirmaram que a comunidade bacteriana é especificamente associada a cada espécie de esponja. Porém quando o método dependente de cultivo foi usado, a comunidade bacteriana nas duas espécies de esponja foi similar, em oposição aos perfis específicos das espécies obtidas por métodos independentes de cultivo. Surpreendentemente, por volta da metade das OTUs (Unidades Taxonómicas Operacionais definidas a uma similaridade de 97% entre sequências do gene 16S do RNA ribossômico) obtidas com este método foi exclusiva deste procedimento. Este resultado demonstra o potencial deste procedimento para a seleção e detecção de filotipos bacterianos menos abundantes que são enriquecidos pelo meio e condições de cultivo, como temperatura e tempo de incubação. Para além disso, a localização e distribuição de células bacterianas associadas às esponjas S. spinosulus e I. variabilis foram determinadas via hibridação in situ por fluorescência juntamente com microscopia eletrônica confocal de varredura (FISH-CLSM). Esta análise revelou que a grande maioria das células procarióticas foram encontradas associadas às células do mesoílo das esponjas e raramente associadas às fibras e filamentos (estruturas de suporte das esponjas), indicando existir uma troca de metabolitos entre a esponja e os simbiontes. De maneira geral a maioria das células bacterianas tinham a forma cocoíde e estavam entre as células das esponjas, de onde colônias bacterianas com alta abundância foram observadas. Quando as comparações entre habitat foram feitas, incluindo as espécies de esponjas, água do mar circundante às esponjas e de sedimentos, observou-se a formação de cinco grupos distintos. Independentemente dos locais onde as amostras foram recolhidas, todas as réplicas de S. spinosulus, Ircinia spp. e Spongia sp. agruparam entre si. O mesmo foi observado com as réplicas de sedimentos. Entretanto, as amostras de água do mar formaram três grupos distintos de acordo com o local de recolha. Para finalizar, a comunidade bacteriana associada à S. spinosulus exibiu um estado de estabilidade dinâmica ao longo de três anos consecutivos, sendo que cerca de metade dos simbiontes observados em S. spinosulus pode ser detectado em todos os anos de amostragem. Notavelmente, a comunidade de Archaea associada à S. spinosulus foi dominada por uma única OTU afiliada com Nitrosopumilus sp., conhecida por sua capacidade em oxidar amônia em condições aeróbicas. Todos os resultados apresentados nessa Tese sugerem uma importância fundamental dos simbiontes para a funcionalidade das esponjas marinhas e, devido à proximidade das células bacterianas com as células ativas da esponja é bastante provável que as mesmas executem funções vitais para manutenção da saúde e desenvolvimento das esponjas. Esta Tese suporta a teoria que a comunidade procariótica é na verdade específica de cada espécie de esponja, então refutando a visão de uniformidade. Está comunidade também foi mantida em diferentes gradientes biogeográficos e temporal. Finalmente, fatores ambientais também desempenham uma importante função como reservatório de bactérias simbiontes para as esponjas marinhas, com destaque para a comunidade encontrada nos sedimentos.

Universidade do Algarve, Faculdade de Ciências e Tecnologia